华蟾毒配基调控肝癌细胞极光激酶A和染色体分离障碍的机理及其协同索拉菲尼抗癌作用研究

Cinobufagin is a main active ingredient of traditional Chinese medicine Chansu and cinobufocini and is applied for the treatment of liver cancer. Cinobufagin and plant source of digitalis and ouabain belong to cardiac glycoside steroids (CSs). Our previous studies firstly found that CSs could effectively inhibit the aurora kinase A (AURKA)-mediated spindle formation and chromosome separation signaling pathway, and then block cell division and induce apoptosis in liver cancer HepG2 cells using SILAC and quantitative proteomics strategy. Meanwhile, activation of AURKA signaling is one of the important factors for sorafenib resistance in the process of clinical liver cancer chemotherapy. Hence, we put forward the scientific hypothesis that AURKA as key target for a combination of cinobufagin and sorafenib could inhibit the proliferation of liver cancer cells and overcome the chemotherapy drug resistance of liver cancer cells.In present study, we will screen the up- and downstream molecules of AURKA pathway using the regulation of AURKA expression (knock down or overexpression) and combination of SILAC and proteomics, and validate the critical molecules expression levels associated with AURKA and signaling pathways by bioinformatics and molecular biology strategy. Meanwhile, we will also analyze the anti-liver cancer activity for a combination of cinobufagin and sorafenib in vitro and in vivo experiments. The research results will provide the clear scientific evidences to definite the anti-liver cancer mechanism of Chansu and relevant preparations as well as improving the clinical medications.

华蟾毒配基（cinobufagin）是治肝癌中药蟾酥和华蟾素等的主要活性成分，属于强心苷类固醇物质（CSs)，我们前期首次通过SILAC-LC-MS/MS技术发现，CS可有效抑制肝癌中与细胞纺锤体形成和染色体分离有关的极光激酶A(AURKA)，阻断细胞分裂。而AURKA和ERK信号途径活化可导致肝癌一线药索拉菲尼耐药。我们提出“华蟾毒配基配伍索拉菲尼以AURKA为关键靶点的抑制肝癌细胞增殖并克服耐药“的假说。我们拟敲除或过表达AURKA，应用SILAC-LC-MS/MS筛查AURKA上下游的调控分子，应用生物信息学和分子生物学手段梳理验证以AURKA为节点的信号途径；应用免疫共沉淀和荧光共定位分析通过AURKA介导染色体分离障碍的互作蛋白，阐释染色体分离障碍的机制；应用体外和荷瘤动物实验观察华蟾毒配基配伍索拉菲尼的抗癌作用。研究结果将为明确蟾酥和华蟾素抗癌机理和改善用药提供科学依据。

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，在我国发病率和病死率分别占恶性肿瘤第三位和第二位，其中90%原发性肝癌为肝细胞癌，起病隐匿，进展迅速，预后极差，大多数患者在确诊时已进展到HCC晚期。索拉非尼是一种起到抗血管生成和抗肿瘤细胞增殖的双重作用，是临床治疗晚期肝癌的一线用药，有效延长HCC患者的生存时间。然而，HCC患者对索拉非尼可产生耐药性，因此，筛选临床中索拉非尼的效应增强剂或协同效应剂成为客观需求。据报道华蟾毒配基以及蟾蜍灵是蟾酥发挥抗癌作用的两种主要活性成分，均属于外源性强心苷类物质，是天然的钠钾泵抑制因子。课题组研究显示华蟾毒配基、索拉非尼单药及联合用药对Huh7细胞的增殖均有明显的抑制作用，联合用药与单药比较增殖抑制作用更明显，具有协同效应；药物作用后可见细胞凋亡形态变化，联合用药组细胞的凋亡形态改变和细胞周期阻滞现象更加明显。定量蛋白组组学筛选90个差异蛋白经生物信息学分析显示AURKA过表达或抑制AURKA表达后，会通过调节纺锤体的形成增强或减弱华蟾毒配基的抗癌作用。涉及主要生物学进程包括DNA损伤，细胞周期，翻译，细胞核分裂以及EGF，MAP，MAPK，PI3K/AKT-mTOR等信号通路。同时荧光共定位分析显示，华蟾毒配基通过AURKA的作用，抑制肿瘤细胞内染色体的分离以及细胞分裂。华蟾毒配基处理会明显减弱AURKA及p-AURKA与TPX2之间的相互作用强度，且TPX2多分布于细胞质和细胞核中，而非中心粒。但AURKA过表达对这一结果无明显改变。这一结果表明，华蟾毒配基通过减少AURKA/TPX2，p-AURKA/TPX2的相互作用，干扰细胞的正常分裂发挥抗肿瘤作用。显示生物信息学分析结果表明AURKA过表达或抑制AURKA表达后，会通过调节纺锤体的形成增强或减弱华蟾毒配基的抗癌作用。课题组通过体内和体外实验研究发现华蟾毒配基主要通过抑制AURKA/Ras/Raf/ERK、AKT/NF-KB和AURKA-mTOR-Eif4E等信号通路，与索拉非尼药物存在显著的抗肝细胞癌的协同化疗机制。研究为以后在临床中的联合应用治疗肝癌提供理论基础。