日本血吸虫凋亡现象观察与分析

Recent studies revealed that apoptosis is a key factor affecting the development and survival of schistosome, but by now little is known about the phenomenon and regulating mechanism of apoptosis for this parasite. The present study will observe and compare the difference on the apoptosis phenomenon between worms from different developing stages from schistosome suitable host mouse and unsuitable host rat. The schistosome apoptosis related molecules will be identified and analyzed, the corresponding information will be added and finally the possible apoptosis pathway for Schistosoma japonicum will be constructed. The expression difference between the molecules involved in the apoptosis pathway in the worms from distinct developing stages from two different suitable hosts will be compared and analyzed, and the apoptosis relative molecules which may affecting the development and survival of schistosomes will be identified. The function and the regulating mechanism of two to three schistosome apoptosis key molecules, as well as how these molecules affecting the development of schistosome will be investigated. The study will accumulate more valuable knowledge for better understanding the schistosome apoptosis phenomenon, and will provide new idea for the elucidation of schistosome development mechanism, as well as for the screening of the new drug targets for the schistosomiasis.

近期研究表明，凋亡（apoptosis）是影响血吸虫生长发育、存活的一个重要因素，但至今人们对血吸虫凋亡现象及其调控机制等仍了解甚少。本申请拟从虫体和细胞二个层面，观察和实验验证日本血吸虫（Schistosoma japonicum）适宜宿主小鼠和非适宜宿主大鼠来源的不同发育阶段虫体的凋亡现象，并比较分析其差异。通过血吸虫凋亡相关分子的鉴定和分析，进一步充实和完善日本血吸虫凋亡通路信息，明确日本血吸虫可能存在的凋亡通路。比较分析两种不同适宜性宿主来源不同发育阶段虫体凋亡通路相关分子的表达差异及哪些凋亡相关分子可能对血吸虫生长发育、存活产生影响。探讨和明确2～3个重要血吸虫凋亡相关分子的功能和调控机制，及对血吸虫生长发育等的影响。本研究将为认识血吸虫凋亡现象积累更多的知识，为阐明血吸虫的生长发育机制，筛选新的抗血吸虫病治疗药物靶标提供理论依据和新思路，具有重要的理论意义和潜在的应用前景。

凋亡是影响血吸虫生长发育的一个重要因素，但至今相关报道仍甚少。.本研究应用透射电镜、TUNEL法、流式细胞术等技术方法在形态、DNA和细胞水平上均观察到部分日本血吸虫童虫和成虫虫体细胞呈现明显的凋亡特征性变化，其中大鼠来源虫体细胞比小鼠来源虫体细胞凋亡现象更为明显。通过对血吸虫基因组数据库的深入挖掘，及PCR扩增和DNA序列分析验证，本研究鉴定了15个日本血吸虫凋亡相关基因，进一步分析推测日本血吸虫存在类似其哺乳动物宿主的线粒体通路和Caspase级联通路等细胞凋亡通路。实时定量PCR技术分析表明大、小鼠来源14、23、32和42天虫体15个凋亡相关基因表达水平存在明显差别。其中14d虫体中基因表达差异较小。感染23天时，大鼠来源虫体中高表达的凋亡相关基因数量明显增多。除Sjcaspase7以外，大多数大鼠来源的32天和42天虫体凋亡相关基因的表达量都高于或相当于小鼠来源虫体，这些凋亡相关基因的差异表达可能是影响日本血吸虫在非适宜性宿主大鼠体内生长发育的重要因素之一。.选择Sjcaspase7、Sjcaspase3、SjAIF、SjBAD、SjTNFR 等5个凋亡相关基因作进一步地研究。应用原核或真核表达系统表达了以上5个基因，制备了免疫血清。应用实时定量PCR技术对凋亡相关基因在不同发育阶段/不同性别/不同宿主来源虫体中的表达状况，及在转染血吸虫凋亡相关基因重组质粒的细胞中的转录水平进行分析。应用IFA和Western blotting 技术验证转染细胞中重组蛋白的表达。通过Caspase酶活检测实验证明了rSjcaspase7和rSjcaspase3重组蛋白具有切割底物DEVD的活性。应用流式细胞术证实了血吸虫凋亡相关基因可在转染细胞中诱导细胞凋亡。应用RNAi技术证实了Sjcaspase7等凋亡相关基因表达受抑制后影响了日本血吸虫的生长发育。动物免疫试验表明重组蛋白rSjBAD具有作为血吸虫疫苗候选分子的潜力。.已发表科研论文20篇，其中SCI收录论文12篇。申报国家发明专利2个。培养博士后和硕士研究生6名。研究成果为认识血吸虫凋亡现象积累了知识，为阐述血吸虫的生长发育机制，筛选新的抗血吸虫病治疗药物靶标或疫苗候选分子提供了新思路。