Bacillus subtilis双精氨酸转运系统中信号肽定向识别的分子机制

The twin-arginine translocation (Tat) is found in Bacillus subtilis that has a Generally Recognized As Safe (GRAS) status, in which the fully-folded cargo proteins are able to be secreted to the outer-space. The typical twin-arginine motiff within the Tat signal peptide is crutial for the recognition of membrane component in the translocation system. For clarifying the mechanism of Tat system in B.subtilis, the LipA is to be designated as the research model for this investigation. We firstly seek to identify the pathway in Tat system that mediating the LipA translocation in vitro and in vivo and unveil the membrane receptor interacting with signal-peptides within the translocation. On this basis, we will identify the essential domains and hot residues for the interaction between signal-peptide and key components in translocation. As well, the effect of those domains and key residues on signal-peptide-membrane receptor interaction will be elucidated respectively. Furthermore, we seek to explore the effect and mechanism of mutual recognition between signal-peptide and the corresponding membrane component. Specially, the contribution of features of Tat signal peptide to translocation functionality and efficiency will also be comprehensively explored and demonstrated. This project is critically important for mutually recognizing membrane receptor by signal-peptide in the course of Tat translocation. Furthermore, this investigation will provide comprehensive understand to that how those early occurrences effect on the substrate translocation. As well, it will guide to unveil the mechanism for substrate proofreading and quality control of Tat system.

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是生物安全的革兰氏阳性菌，可利用双精氨酸转运（Tat）系统分泌折叠成熟的蛋白质。Tat信号肽中典型的双精氨酸基序在识别膜转运组件中其重要的作用，但其与转运膜组件定向识别的分子机制及影响这一过程的机理目前尚不清楚。本研究拟以B.subtilis脂解酶LipA转运为模型，从体内和体外两个水平鉴定Tat系统引导LipA识别的转运途径，解析与LipA信号肽相互识别的膜转运组件，系统探讨LipA信号肽与膜转运组件之间互作的关键结构域及热点氨基酸对识别的影响和作用机制，阐明LipA信号肽与膜转运组件的识别以及LipA信号肽结构域的特性对Tat转运系统转运效率的影响作用及分子机制。此研究不仅为全面理解Tat转运早期影响底物转运的机理提供理论参考，也为阐明Tat底物校读/质量控制的分子机制奠定基础。

基因表达调控和重组蛋白质的转运是两个非常重要的生物学过程，决定了重组蛋白质的表达和分泌水平，由此构成的生物体系在合成生物学中有着重要的作用。启动子元件、转录翻译调控元件和信号肽分别从三个层次调节了这两个过程。因此，在枯草芽孢杆菌中解析不同启动子的工作模式，探讨新的转录和翻译调节元件的功能，阐明信号肽对转运效率和特异性对目标蛋白分泌的影响对于将枯草芽孢杆菌开发成先进的合成生物学底盘有着重要的意义。.基于此，研究首先分析了B.subtilis168随培养时间渐进的转录组学数据，从中筛选出了一个生长阶段依赖型的启动子srfA。经过鉴定，这一启动子可以在菌体生长后期高水平表达。通过遗传改造，大幅提高了srfA启动子的转录活性。在分析了枯草杆菌的分泌组学数据基础上，利用GFP报告基因证明了在枯草芽孢杆菌168菌株中能高效分泌重组蛋白的信号肽YncM。进一步研究表明，YncM信号肽同样能够高水平分泌氨肽酶，最大分泌水平达到92 U/mL。为进一步在双精氨酸转运系统中寻找和鉴定高转运型信号肽提供了参照模型。随后，在B. subtilis中构建出了两种主要转运酶的单敲除菌株ΔTatAd和ΔCd。并在两株转运酶缺陷菌株中验证了大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中Tat依赖的ssTorA和ywbN信号肽分泌效率，证实了ywbN信号肽可以引导GFP以及外源重组蛋白大肠杆菌天冬氨酸酶（EcAspA）的转运。这一结果表明，B. subtilis来源的ywbN能够转运折叠完整的、有活性的外源重组蛋白，在蛋白质分泌质量上有着比Sec途径依赖的信号肽更优秀的特性。在对ywbN信号肽中S/TRRXFLK保守序列中的RR突变过程中，发现将RR突变为不同带电特性的氨基酸残基对ywbN引导的蛋白质转运影响有差异。将两者同时突变为Ala后完全使转运失活。这一结果对选择改造Tat转运途径的信号肽元件提供了基础，初步揭示了ywbN信号肽组件的分子特征对蛋白质转运效率的影响机理。这一结果为研究Tat信号肽和膜转运组件的共进化提供了技术条件。.综上，本项目解析了决定影响从基因转录，到翻译起始控制，再到蛋白转运这一从DNA到翻译后修饰整个过程的机理，确证了具有特殊自诱导特征的启动子以及Tat信号肽之间的共进化提供了技术平台。