拟南芥K+/H+反向交换体AtKEA基因家族的生化特性和生物功能研究

拟南芥AtKEA基因家族包括6个基因。 序列分析显示AtKEA基因与细菌K+/H+反向交换体KefB和KefC极为相似，暗示AtKEA基因可能编码K+/H+反向交换体，在植物体内钾离子分配和细胞钾离子运输等方面起着重要的调控作用。然而目前尚无任何有关AtKEA 基因家组离子转运特性和生物功能的报道。我们将运用分子生物学和生物化学技术和方法首次从膜微囊， 酵母和植物三个层次对拟南芥AtKEA基因家族的离子转运特性, 基因表达模式, 蛋白质细胞定位以及生物学功能进行全面研究,以期阐明拟南芥AtKEA基因家族在钾营养、抗盐胁迫，细胞pH调节和膜微囊运输及生物膜融合等方面的生物学功能，为全面揭示植物钾营养代谢机理，阐明植物生长发育规律以及提高植物钾离子利用效率等奠定重要理论基础。力争在植物K+/H+反向交换体领域做出重大突破性的研究成果。

Na+,K+/H+ 反向转运体的生物功能是跨膜转运Na+ 或K+，同时进行H+的反向转运。它们在Na+ 和K+ 的转运，耐盐性，细胞周期和细胞增殖的调节，膜微囊运输和生物膜融合，以及生物合成等起着重要的调节作用。AtKEA基因家族包括6个基因。目前对于AtKEAs的离子转运特性和生物功能尚缺乏实验研究。本课题采用酵母生长实验，GUS染色, RT-qPCR以及GFP标签技术，首次研究了AtKEA基因家族的离子转运特性，基因表达模式和亚细胞定位。AtKEAs与细菌K+/H+反向交换体KefB和KefC及酵母K+/H+反向交换体ScKHA1的基因序列高度相似，表明AtKEA可能编码K+/H+反向交换体，在植物钾离子调控方面起着重要的作用。同时发现，AtKEAs与AtNHXs和AtCHXs分布在不同的进化枝上，暗示AtKEAs的功能可能不同于AtNHXs和AtCHXs。AtKEA基因家族的6个基因在进化分支中形成两个亚组：AtKEA1-3 和AtKEA4-6。AtKEA1和AtKEA2具有较长的N端结构域；全长AtKEA1在酵母细胞中没有离子转运活性。我们采用缺失离子转运蛋白的酵母突变体，分析AtKEA的离子转运特性。AtKEA基因家族能够抵抗高浓度K+ 和潮霉素的胁迫，但是不能抵抗盐胁迫和Li+ 胁迫。AtKEA基因家族在拟南芥根和叶上均有表达。在低浓度K+ 胁迫下，AtKEA1, AtKEA 3和AtKEA 4的表达增强；AtKEA2 和AtKEA5在山梨醇与ABA处理下表达增强。然而，AtKEA2 和AtKEA5在aba2-3突变体中未表现出渗透响应，说明AtKEA2 和AtKEA5的渗透响应是受ABA的调节。在sos突变体中，AtKEA基因的表达不受影响，表明AtKEA基因的表达可能不受SOS途径的调节。在酵母细胞中，通过GFP融合蛋白分析发现AtKEA基因家族的细胞定位具有多样性。在拟南芥中，通过原生质体瞬时表达分析及稳定转化分析发现，AtKEA3定位于高尔基上。我们还发现，keaX keaY 双突变体植株矮小，发育迟缓，说明AtKEAX和ATKEAY基因调节植物的生长发育。有关机理目前正在研究之中。我们的结果显示，AtKEA基因家族成员在细胞中具有不同的表达模式和亚细胞分布；AtKEA基因在拟南芥中可能具有促进K+ 的体内平衡和渗透调节的作用。