控制性叶酸剥夺法诱导iPS细胞技术理论及转化应用的研究

Induced pluripotent stem (iPS)cells pave a way in regenenrative medicine for evading the ethical and immunological incompatibility issues of embryonic stem cells.The remaining technical barriers in the reprogramming process are the inefficiency and tumorigenicity.It has proved that cell reprogramming is corrate with DNA methylation ,which is demethylation could improve the induced efficiency of iPS cells.Folate participate in DNA methylation by providing or accepting onecarbon unit, folate-deprived could induce DNA demethylation, and our experimental results also show that mouse embryonic fibroblasts were cultured in non-folate condition,the promoter region of Oct4 and Nanog demethylated partly,c-Myc increased expression and P53 decreased. As a result, we'd like to controlled deprive folate in cell culturing, maybe improve the inducing efficiency,and also decrease the number of transcription factors to reduce the tumorigenicity；at the same time,we will instead lack-folate by U0126,a MAPK signal inhibitor,to explore the mechanism of cell reprogramming. And the ultimate purpose is that inducing iPS cells by the pure small-molecule chemicals gradually,providing enough safer iPS cells for cell therapy,and bringing out a platform for studying its' mechanism and exploring the application in translational medicine.

诱导多潜能干（iPS）细胞的出现规避了胚胎干细胞的免疫原性和伦理学问题，从而为其在再生医学方面的应用开辟了新道路。但在iPS细胞应用前必须解决其诱导效率低和致瘤性问题。研究证明，细胞重编程与DNA甲基化有关，去甲基化可能提高iPS细胞的诱导效率。叶酸通过提供或接受一碳单位参与DNA的甲基化过程，当细胞无叶酸时可引起基因组的低甲基化；我们的预实验结果显示叶酸缺乏可使靶细胞Oct4和Nanog启动子部分区域去甲基化，原癌基因c-Myc表达增高，抑癌基因p53表达降低。故本研究试图通过对靶细胞进行控制性叶酸剥夺，在可能提高iPS细胞诱导效率的同时，还可能替代部分外源性转录因子降低致瘤性；并通过U0126替代叶酸缺乏条件，丰富iPS细胞诱导机制。最终试图通过对靶细胞进行可控性的叶酸剥夺，逐步实现完全利用小分子化合物诱导iPS细胞，为细胞治疗提供足量、安全的细胞，为其理论研究和转化应用的探索提供平台

诱导多潜能干（iPS）细胞的出现为再生医学开辟了新的道路。但在其大规模投入临床应用之前，存在诱导效率低、外源基因插入、致瘤性等问题，以及在培养过程中难以避免外源性动物因素的污染，这些都极大限制了iPS细胞的临床转化应用。本研究通过建立叶酸剥夺培养体系，完成了鼠胚胎成纤维细胞重编程为iPS细胞的研究，提高了IPS细胞的诱导效率（0.05%vs0.01%），并减少了外源性转录因子（c-Myc）的使用，降低了iPS细胞的致瘤性。同时：我们采用叶酸剥夺培养联合小分子化合物的方法，在提高诱导效率的前提下进一步减少了重编程因子的使用数目，实现了四因子（Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc）、三因子（Oct4，Klf，Sox2）、两因子（Oct4，Klf）条件下iPS的诱导。通过上述实验研究，成功建立了提高iPS细胞诱导效率并降低其致瘤性、进一步减少外源性重编程因子使用的技术。在实验进展的过程中：我们积极关注国内外iPS技术的最新进展，为了尽早将iPS细胞技术向临床实际应用过渡，我们使用了来源于人的皮肤成纤维细胞作为靶细胞，并采用质粒电转技术这一全新的重编程方法，向细胞内转入pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK，pCXLE-hUL，pCXLE-EGFP四种编码重编程因子的质粒，避免了病毒载体的使用及外源性基因的整合，与无血清无饲养层培养体系相结合，完成了人皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞的研究。通过使用非基因整合型附着体质粒联合小分子化合物组合（丁酸钠，A83-01，CHIR99021，Y-27632），建立了无饲养层无血清无病毒载体条件下人类iPS细胞的诱导体系，诱导效率最高可以达到0.1%。这为iPS细胞将来应用于疾病机制和疾病治疗研究打下了基础。同时：我们建立了从人尿液细胞中提取尿液源性干细胞的方法，以及通过人尿液细胞为来源重编程iPS细胞的方法，使得取材更加方便，患者的接受度更高，进一步加速了iPS细胞技术向临床实际应用的步伐。在推进iPS细胞的具体临床实用化的道路上，我们也进行了相关的前期探索：通过在体外将iPS细胞定向分化为神经细胞及运动神经元，以及通过拟胚体和神经嵴阶段将其诱导分化为血管平滑肌细胞或内皮细胞等，为iPS细胞将来应用于神经系统疾病、血管性疾病的研究提供了行之有效的途径。