三维诱导人胚胎干细胞来源的肝系细胞构建人源化肝脏小鼠模型用于HCV的研究

HCV感染是引起终末期肝病的主因。缺乏适宜的细胞和小动物模型阻碍了对其发病机理和治疗的研究。因其感染的种属特异性，利用人肝系细胞植入小鼠肝脏构建人-鼠嵌合模型意义重大。感染性HCV和肝损伤免疫缺陷小鼠是该疾病模型构建的前提；对HCV易感、并具有高度增殖、功能分化和植入能力的靶细胞则是关键，也是以往研究中被忽视的问题。本项目基于肝干细胞发育生物学和HCV感染病变特点，以具有高度增殖和分化潜能的人胚胎干细胞为种子细胞，通过小分子、细胞外基质（ECM）组合等建立三维细胞诱导微环境以提高细胞-细胞、细胞-ECM间相互作用，重点解决如何提高干细胞增殖分化效率、分化细胞对HCV易感性及其在小鼠肝脏中整合等问题；通过系列关键技术集成，从新角度提出建立模拟HCV感染的人源化肝脏小鼠模型策略。该模型建立将为HCV生命周期、致病性研究和新药物靶点筛选提供技术平台，也为突破疾病动物模型建立的传统模式探索新思路。

1. 项目背景. 丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）感染是引起终末期肝病的主要原因，全球约有1.75亿慢性感染者，约占总人口的3%，并以每年新增400万病例的速度发展，我国HCV感染者也超过6000万，HCV感染已成为危害人类健康的全球性问题。目前缺乏适宜的体外肝细胞长期培养体系和小动物模型是造成HCV感染发病机理探索及其治疗研究相对滞后的主要原因。多年来，人们努力通过改进人原代肝细胞或肝癌细胞系的培养条件等多种策略，以期建立HCV高效复制和感染的体外模型。由于HCV生活周期的复杂性和体外细胞模型固有的局限性，远不能模拟病毒的自然感染及体内病毒的真实生活周期规律和与宿主的相互作用，更遑论用于抗病毒药物的筛选和评价，而通过在动物整体水平建立模拟HCV感染的模型解决上述问题，对于我们这样一个病毒性肝炎及终末期肝病高发的国家尤其具有重要的科学和临床意义。.2. 主要研究内容. 以人ESCs为种子细胞，根据肝脏体内分化发育过程，利用分步诱导策略，从ECM组合、可溶性小分子和细胞因子组合，以及其他细胞分化所需要的微量元素等条件入手，建立优化的肝向诱导分化体系；在此基础上，以体外培养的HCVcc为感染性病毒，开展人ESCs来源的肝系细胞对HCV易感性的研究；以Fah-/-Rag2-/-小鼠为受体，构建HCV慢性感染的人源化肝脏小鼠模型。.3. 重要结果、关键数据及其科学意义. 本项目以人ESCs或谱系重编程获得的内胚层祖细胞为种子细胞，根据肝脏体内发育分化规律，利用分步诱导策略，从ECM组合、可溶性小分子和细胞因子组合，以及其他细胞分化所需要的微量元素等条件入手，建立了高效的体外肝向诱导分化系统；在此基础上，以我国流行的HCV亚型（1b型）HCVcc作为病毒来源，探索HCV在肝向发育各阶段的动态感染规律，结果显示不同干细胞来源的肝祖细胞均具有最高的HCV易感性，这一发现为临床HCV感染慢性化特征提供了新的理论支持；以Fah-/-Rag2-/-（FR）小鼠为受体，HCV感染的肝祖细胞能够有效移植入FR小鼠肝脏，HCV在肝组织原位可以持续存在超过12周。这些结果对HCV感染研究提供了新的视角，为HCV宿主细胞、生命周期以及抗HCV药物的筛选与评价研究提供了体内外的新的研究模型。