补肾活血法促创伤性股骨头坏死骨修复的microRNA调控途径研究

Trauma-induced osteonecrosis of femoral head (TIONFH) is major complication of femoral neck fractures.The repair capacity of necrotic bone determines the prognosis of femoral head, the repair process of bone is closely related to osteoblast (OB) differentiation. It is found that endogenous microRNA (miRNA) plays a regulatory role in the process of OB differentiation.Previous studies have shown that Bushenhuoxue method can promote the healing of femoral neck fracture, reduce the incidence of TIONFH, but related mechanisms is unclear. Therefore, we hypothesize that specific miRNA in TIONFH patients maybe involved in bone repair, which maybe the target miRNA in the role of Bushenhuoxue method.For this reason,this research has three parts: first, to checkout the changes in miRNA expression profile in plasma with TIONFH patients,compared with who treatment of Bushenhuoxue method through high-throughput screening method ,then QPCR is adopted for miRNA expression and target genes; Second,to explore the differences with miRNA function and determine its target genes with overexpression and siRNA into human bone marrow stem cells (BMSCs) technique, and then to study the transcriptional regulation of target miRNA in Bushenhuoxue method;Third, to investigate the effect of traditional Chinese medicine in Bushenhuoxue method on TIONFH rabbits with target gene transfection BMSCs transplantation,which is regulated with the most notable differential expression miRNA target gene.

创伤性股骨头坏死(TIONFH)为股骨颈骨折的主要并发症。坏死骨修复能力决定股骨头的预后，骨修复过程与成骨细胞（OB）分化密切相关。研究发现内源microRNA（miRNA）在OB分化过程中起调控作用。前期研究表明补肾活血法可促进股骨颈骨折愈合，降低TIONFH发生率，但作用机制不清楚。因此，我们推测TIONFH患者可能存在特异miRNA参与骨修复，且可能是补肾活血法作用的靶miRNA。本课题①拟采用高通量筛选法检测TIONFH患者及补肾活血法治疗的患者血浆中miRNA表达谱变化，筛选差异miRNA，QPCR验证miRNA表达并预测其靶基因；②采用超表达和siRNA质粒瞬时转染人骨髓干细胞（BMSCs）技术研究差异miRNA的功能并确定其靶基因，研究补肾活血法对靶miRNA的转录调控作用；③研究补肾活血中药联合最显著差异表达miRNA调控的靶基因转染BMSCs移植修复兔TIONFH的效果。

将血浆miRNA的研究领域拓展至创伤性股骨头坏死（TIONFH），通过高通量筛选的方法确立TIONFH患者特异性表达的miRNA及其调控的靶基因，为研究TIONFH的发病机制奠定基础。通过体外实验与动物实验，探明这些特异性miRNA的功能并确定其对应的靶基因，从基因调控方面寻找中医药治疗TIONFH的靶点，为中药联合基因治疗TIONFH提供循证医学的根据。为进一步确立补肾活血中药治疗TIONFH的特异性miRNA及其调控的靶基因提供研究基础。挑选临床病例入组，抽取外周血，使用Axon GenePix 4000B芯片对2组患者进行芯片筛选，找出差异表达的miRNA。挑选5个显著上调和5个显著下调的运用QPCR技术进行验证。其次，运用体外细胞实验对hsa-miR-93-5p的功能和其调控的靶基因对hBMSCs增值及分化进行了深入研究。我们通过体外细胞实验研究了补肾活血药水提物对hBMSCs增值及分化的影响，探讨其与hsa-miR-93-5p之间的关系。借助动物实验与细胞实验相互验证，证实了miR-93-5p对TIONFH的调控作用。.两组患者Harris评分和VAS评分有统计学意义外。通过芯片检测共计发现95个miRNA的表达上调和413个表达下调。 “火山”法分析筛选了147个差异miRNA，分别是35个上调和112个下调。挑选具有显著差异的10个基因进行进一步研究，分别是5个显著上调基因和5个显著下调基因。我们对其进行了GO分析和passway分析，最后进行了靶点预测分析。采用了QPCR技术对挑选的10个基因进行验证，结果发现有8个基因与芯片符合。最终选择hsa-miR-93-5p来进行下一步的研究。其次，我们发现BMP-2是miR-93-5p调控的靶基因，miR-93-5p可抑制BMP-2的表达。外源性miR-93-5p抑制hBMSCs细胞的成骨并抑制成骨相关基因的表达，同时降低成骨相关蛋白表达从而抑制hBMSCs成骨分化。再次我们发现补肾活血中药-股骨头坏死愈胶囊（FHNHC）有加强成骨诱导液促hBMSCs成骨分化的作用并促进hBMSCs的增值。FHNHC可逆转hBMSCs中miR-93-5p表达而造成的成骨抑制。最后我们运用动物实验与前面实验进行了相互验证。