干旱条件下生长素受体TIR1的亚硝基化修饰在调控万寿菊不定根发生中的功能研究

Drought stress is one of the main problems affecting agricultural production, and understanding the signal transduction mechanisms behind plant tolerance and stress response will help us to develop new means of strengthening fruitful agronomy. Nitric oxide (NO) is one of the important signal molecules in plant response to stress. Protein S-nitrosylation is a redox-based post-translational modification of thiol residues. Adventitious root is an important issue both on the theoretical aspect of plant development and organogenesis and on the practical side of plant propagation and excised issue or organ regeneration. Our previous study revealed the signal interactions between NO and other signal molecules during rooting in marigold under drought stress and the interactive mechanisms. On the basis of our previous studies, two-dimensional electrophoresis, biotin switch assay, Co-immunoprecipitation with mass spectrometry, yeast two-hybrid analysis and high performance liquid chromatographic analysis will be used to study the protein S-nitrosylation of the auxin receptor TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1 (TIR1) in marigold under drought stress in the current study. The S-nitrosylation will regulate the TIR1–Aux/IAA interaction, subsequently promote activation of signaling pathways downstream, and finally regulate the formation of adventitious roots in marigold. These results will underline the roles of the protein S-nitrosylation of the auxin receptor TIR1 during rooting under drought stress and its molecular mechanism. Our findings will illustrate a mechanism by which NO signaling and protein post-translational modification coordinate adventitious root development under in plants drought condition.

干旱是严重影响农业生产的环境因子之一，干旱胁迫信号转导机制的研究对于培育抗旱植物具有重大意义。一氧化氮（NO）是植物响应逆境胁迫的重要信号分子，蛋白质巯基亚硝基化修饰是一种典型的氧化还原依赖的翻译后修饰。植物不定根发生问题是植物无性繁殖和工厂化育苗实践的核心问题，也是植物发育和形态建成等方面的重要理论问题。我们前期研究已探讨了干旱条件下万寿菊不定根发生中NO和其它信号分子的互作及其生理生化机制。本研究拟采用双向电泳实验、生物素转化法、免疫共沉淀技术结合质谱分析、酵母双杂交系统以及高效液相色谱等手段证明干旱条件下万寿菊的生长素受体TIR1能被巯基亚硝基化修饰，该修饰能调控TIR1和Aux/IAA蛋白的互作，激活下游通路，进而调控万寿菊不定根的发生。拟探讨生长素受体TIR1亚硝基化在干旱条件下不定根发生中的作用及其分子机理，进而揭示干旱条件下NO调控植物不定根发生中蛋白质翻译后修饰的分子机制。

干旱是影响农作物生产的主要环境因子。不定根发生是植物无性繁殖的重要步骤。一氧化氮（NO）被认为是钙离子（Ca2+）之后的第二信号分子，广泛参与植物的生长发育和胁迫响应过程。本试验以万寿菊外植体为材料，从生根相关指标、转录组学、活性氧清除系统和生长素受体蛋白质TIR1的S-亚硝基化等几方面，研究了干旱条件下生长素受体TIR1能被S-亚硝基化修饰，进而调控抗氧化能力、蛋白的互作和激活下游通路，进而调控万寿菊不定根的发生，为今后不定根的发生研究与应用提供了理论参考。主要研究结果如下：.（1）中度干旱显著抑制了不定根的发生。干旱胁迫下，适宜浓度的外源NO供体SNAP(10 μM）显著增加了不定根的根长和根数。可见，NO作为正向调控因子参与了干旱胁迫下不定根的发生。.（2） 经转录组测定分析，筛选出3237个DEGs。其中，1519个DEGs下调，1808个DEGs上调。通过GO富集分析，NO处理在生物过程子类中最显著的条目是“光合作用”，细胞组成子类中最显著的是“类囊体”。通过KEGG富集分析，进一步鉴定了参与NO诱导黄瓜不定根发生的关键通路和关键基因，包括光合作用（共23个DEGs）、植物激素信号转导（共47个DEGs）和谷胱甘肽代谢（共18个DEGs）。.（3）GSNO促进了干旱胁迫对SNO、NO含量和总S-亚硝基化蛋白水平的增加作用。然而，NO清除剂cPTIO显著降低了SNO和NO含量。干旱胁迫显著提高了S-亚硝基谷胱甘肽还原酶（GSNOR）活性，而GSNO显著抑制了干旱胁迫促进的GSNOR活性增加。NO清除剂cPTIO又增加了GSNOR活性。可见，外源NO可能通过调控干旱胁迫下蛋白质S-亚硝基化水平来促进不定根的发生。.（4）干旱胁迫下，GSNO降低了丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）和超氧阴离子（O2-）含量，升高了抗坏血酸（AsA）、还原型谷胱甘肽（GSH）含量、抗氧化基因的表达以及抗氧化酶活性。但是，NO清除剂cPTIO显著降低了GSNO对外植体抗氧化的促进作用。可见，NO可能通过增强抗氧化能力，清除下胚轴中的活性氧，促进干旱胁迫下不定根的发生。.（5）TIR1蛋白可以被S-亚硝基化修饰，修饰位点为Cys 140或Cys480。 且TIR1被S-亚硝基化修饰后增强了与和Aux/IAA蛋白的互作。