海人酸受体亚单位GluR6巯基亚硝基化在癫痫发生中的作用及其机制

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common form of adults. Despite intensive research, the molecular mechanisms for TLE remains poorly understood. Kainate receptors, as a kind of ionotropic glutamate receptors, play an important role in epileptogenesis. Recently, its subunit GluR6 attracts great attention. S-nitrosylation, as an important form of protein post-translational modification, widely affects cell functions. However, it is unclear whether S-nitrosylation of GluR6 itself is involved in epileptogenesis, as well as how the level of intracellular calcium regulates S-nitrosylation of GluR6. By using in vitro cultured hippocampal neurons, Kainic acid-induced epileptic animal model, the proposal will focus on how endogenous/exogenous nitric oxide and different routes of calcium ion flow affects S-nitrosylation of GluR6 in the hippocampus neurons, GluR6-mediated whole cell current, as well as epilepsy behavior and hippocampal damage. Subsequently, the proposal will determine the role of S-nitrosylation of GluR6 in epilepsy behavior and hippocampal damage by using genetic site mutation. Finally, the proposal will examine the expression level and S-nitrosylation of GluR6 in different regions of the hippocampus of TLE patients with different pathological types and different duration of disease, and then evaluate its correlations with epilepsy. Taken together, the proposal will not only deepen the understanding of pathogenesis of epilepsy, but also provide a new target for epilepsy and other relevant neurological diseases.

颞叶癫痫是成年人一种最常见的癫痫形式，但是关于它的分子机制仍然知之甚少。海人酸受体在癫痫发生中发挥重要的作用，尤其亚单位GluR6近期受到人们的关注。巯基亚硝基化作为蛋白质翻译后修饰的一种形式广泛影响细胞功能。然而并不清楚GluR6巯基亚硝基化在癫痫发生中的作用，以及胞内钙离子如何调节GluR6巯基亚硝基化。本项目首先在体外培养的海马神经元和体内海人酸诱导的动物癫痫模型上探讨内源性和外源性一氧化氮以及不同路径的钙离子流如何影响海马内GluR6巯基亚硝基化、GluR6介导的全细胞电流以及癫痫行为和海马损伤。继而采用遗传学位点突变方法进一步明确GluR6巯基亚硝基化在癫痫行为和海马损伤中作用。最后在不同病理类型和不同病程的颞叶癫痫患者上确定不同海马区GluR6亚单位的表达和巯基亚硝基化水平以及它与癫痫的相关性。总之，该项目不仅加深理解癫痫的发生机制，而且为研发抗癫痫药物提供新的靶点。

颞叶癫痫的分子机制仍知之甚少。海人酸受体尤其亚单位GluR6在癫痫发生中发挥重要作用，而巯基亚硝基化（SNO）作为蛋白质翻译后修饰的一种形式广泛影响细胞功能，然而并不清楚GluR6-SNO在癫痫发生中的作用，以及胞内钙离子如何调节它。体外执行海人酸KA刺激培养的海马神经元实验，包括KA诱导的GluR6-SNO 的剂量依赖和时程，以及AMPA和KAR受体抑制剂实验，操纵内源性NO和细胞内钙离子水平对KA诱导的GluR6-SNO的影响，通过膜片钳确定GluR6-SNO对KAR离子通道功能的影响。体内侧脑室给予海人酸建立急性癫痫模型，海马内CA1和CA3区GluR6-SNO在KA给予后的时程，以及阻断KAR对其的影响；通过NOS的抑制剂和不同的钙离子拮抗剂的应用，观察KA诱导CA1和CA3区GluR6-SNO的影响；通过抑制GluR6-SNO，观察KA诱导CA1和CA3的神经元保护情况；通过免疫沉淀方法观察KA诱导的GluR6-PSD95-nNOS复合物形成；通过应用Tat-GluR6-9c 多肽和PSD95 AS-ODNs观察两者干扰GluR6-PSD95-nNOS复合物形成。 基于这些结果，我们提出GluR6-SNO在海人酸导致的神经元损伤模型，为将来开发特异性靶点药物提供实验依据。长期低频重复经颅磁刺激治疗癫痫的分子机制，尤其ceRNA网络(LncRNA-miRNA-mRNA）的具体调控尚不清楚。采用高通量测序技术，鉴定低频rTMS和假性刺激治疗癫痫持续状态小鼠的差异表达LncRNA、miRNA和mRNA谱，执行GO和KEGG富集分析，构建了基因相互作用网络，筛选出关键基因。用qRT-PCR技术验证了基因的相互作用。结果提示：低频rTMS治疗癫痫持续状态小鼠与假性刺激组分化表达1615个LncRNAs、510个mRNAs以及17个miRNAs。在qPCR和微阵列检测中，lncRNAs、mRNAs和miRNAs的表达差异是一致的。GO分析表明，免疫相关分子机制和生物学过程、GABA-A受体活性在低频rTMS治疗癫痫持续状态小鼠中起一定作用。KEGG分析显示差异表达基因与T细胞受体信号通路、原发性免疫缺陷、Th17细胞分化信号通路相关。构建基于Pearson相关系数和Miranda的基因交互网络。结论：LF-rTMS通过调节免疫信号通路以及GABA受体活性促进癫痫恢复。