心力衰竭心肌肌钙蛋白I变化致RCAN3解抑制CaN-NFAT的机制研究

心肌肌钙蛋白I（cTnI）目前是临床判断心衰预后的血清标志物之一。我们以往研究证实心衰患者心肌cTnI有高降解及高磷酸化。前期研究：cTnI低表达转基因小鼠心肌Calcineurin(CaN)-NFAT通路激活,β-MHC再表达，提示心肌cTnI变化作为起动因素促进心肌重构。本课题拟以cTnI与RCAN3的相互作用为切入点，探讨心衰时cTnI变化（表达异常/磷酸化/渗漏）致心脏重构的分子机制。首先通过观察心肌细胞内cTnI变化时RCAN3、CaN-NFAT通路及下游基因变化，获得cTnI与RCAN3-CaN-NFAT信号通路相关性的充分实验证据；进一步证实RCAN3是cTnI调节CaN-NFAT通路的关键点；最后观察调节心肌细胞cTnI或RCAN3表达，对心衰时心肌重构的影响，阐明病理状态cTnI变化致RCAN3解抑制CaN，进而促进心肌重构的机制，cTnI/RCAN3可作为心衰干预靶点。

心脏肌钙蛋白I （cTnI）是目前为止认为仅表达在心肌组织的肌小节蛋白质。本课题组在以往研究中观察到因心肌病、心力衰竭而行心脏移植术的患者心脏cTnI呈现高降解/高磷酸化，与心脏重构相关。钙调神经磷酸酶（CaN）是受钙/钙调素调节的丝/苏氨酸磷酸酶。CaN-NFAT通路激活被认为是特异性调节病理性心肌肥厚的重要途径。心肌细胞CaN的活性受内源性的CaN调节因子（即RCAN1-3)及空间抑制（即Z线抑制)调控。已有报道证实RCAN3和cTnI相互作用。本研究探索RCAN3是否是心肌细胞cTnI变化后CaN-NFAT通路激活的关键点。我们通过ISO致cTnI高磷酸化、整合素刺激cTnI高渗漏及siRNA致cTnI低表达心肌细胞实验，观察cTnI不同变化对RCAN3抑制CaN-NFAT通路的影响。cTnI不同变化增高胞浆游离钙、激活CaN-NFAT或下游基因。RCAN的变化与原设想不一致，呈现无变化、胞核分布或与CaN同时表达增高等不同表现。多重免疫荧光发现cTnI与RCAN3分别在心肌细胞胞浆及胞核表达，在细胞学无重合定位，而cTnI与Calsarcin-1定位重合。利用本室建立的心脏cTnI高/低表达小鼠，与同基因背景B6小鼠比较，4-12月龄LVEF未见明显降低。cTnI低表达小鼠8月龄β-MHC增高，CaN及NFAT活性增高，心肌间质纤维化。cTnI心脏高表达小鼠4月龄心脏β-MHC降低、NFAT增高,10月龄ANP降低，而RCAN1-3变化无统计学差异。现有实验结果不支持RCAN3是心肌细胞cTnI变化后CaN-NFAT通路激活的关键点，与原设想不同。本课题在实施中，因细胞学阴性对照实验，无意发现cTnI在肿瘤组织及细胞表达。我们收集了49例非小细胞肺癌（NSCLC）患者病理标本，69.4% cTnI表达呈阳性。培养人胃癌BGC 823及人肺癌SPCA-1细胞株，免疫荧光检测7株抗cTnI不同表位抗体在 BGC 823及SPCA-1细胞株中染色呈阳性，并具有表位控制特点,胞核存在稳定cTnI-cTnC结合体。肿瘤细胞株中cTnI mRNA 的表达量仅为心肌细胞万分之一。抗cTnI单抗干预BGC 823细胞48小时不影响细胞增殖，RCAN1-3在BGC 823细胞上不表达。cTnI可能成为联系心脏病及肿瘤两大疾病的桥梁分子。