变异链球菌LTA结构及dlt基因缺失对菌株致龋力的影响

Streptococcus mutans (S. mutans) has been recognized as the main cariogenic bacteria. It was reported that the number of S. mutans is not the only determining factor in the process of caries, but the different cariogenic ability of strains is an important factor. It is well known that the ability of biofilm formation and acid tolerance are the main cariogenecities of S. mutans. Lipoteichoic acid (LTA), a key constituent of cell envelopes, is pathogenic component of S. mutans. S. mutans LTA is known to stimulate inflammation of periodontal tissue, as well as the D-alanylation of LTA in gram-positive organisms is the essential virulence factors, and dlt operon comprised of dltA, dltB, dltC, and dltD. We hypothesized that the dlt play a crucial role in biofilm formation and acid tolerance of S. mutans. Therefore, in this study, the structure of S. mutans LTA which obtained from clinical strains 593 and 18 (isolated from caries-active and caries-free individuals in our previous studies, respectively), and standard strains ATCC 25175 will be compared. Furthermore, the dlt-deleted mutant strains of S. mutanswill be constructed to investigate the role of dlt gene in biofilm formation and acid tolerance of S. mutans. We assume that the findings of this study will provide a potential and novel way to detect virulence factor of S. mutans and to improve the accuracy of the caries risk assessment.

变异链球菌（简称变链菌）作为公认的主要致龋菌，现有研究表明其数量并不是致龋过程中唯一的决定因素，其菌株间质的差异也是重要影响因素。而变链菌最重要的致龋毒力因子就是菌株形成生物膜的能力和耐酸性。脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）是存在于变链菌细胞壁的致病成分。变链菌LTA 除了可诱导牙周组织炎症，LTA的右旋丙氨酸酯结构（dlt操纵子包括dltA、dltB、dltC和dltD）也影响着革兰阳性菌的毒力，因此本研究提出假说：dlt基因在促进变链菌形成生物膜和耐酸能力方面也具有重要作用。为验证假说，本项目组拟提取并比较高、低致龋力变链菌临床株593号和18号（前期研究分别分离自高龋患者和无龋健康人）以及标准株ATCC 25175的LTA，并通过构建dlt基因缺失突变株，探讨dlt基因在变链菌生物膜形成和耐酸能力中的作用。为寻找致龋毒力因子，提高龋病风险性预测的准确性奠定基础。

变异链球菌（Streptococcus mutans, S. mutans）是龋病的主要致病菌，生物膜形成能力和耐酸性是其重要的毒力因子之一。研究表明 S. mutans 的脂磷壁酸 （Lipoteichoic acid，LTA）在其生物膜形成和耐酸能力中具有重要作用，但是其机理尚不清楚。本研究首先采用正丁醇提取技术提取了S. mutans高致龋力593号临床株（SM593）、低致龋力18号临床株（SM18）以及标准株 ATCC25175（SM25175）的脂磷壁酸 （Lipoteichoic acid，LTA）。通过将提取物采用傅里叶红外光谱检测后证实为LTA，说明该提取方法可行。进而采用核磁共振氢谱分析发现 三个菌株之间LTA结构存在差异。本实验进一步发现三个菌株在与LTA功能密切相关的细菌表面电荷和细菌疏水性均有所不同。采用qRT-PCR检测对三个菌株在生物膜和浮游状态下 dlt操纵子包括dltA、dltB、dltC、dltD基因表达水平，发现生物膜状态下三个菌株的四个基因表达水平均高于其浮游状态下（p<0.05）；SM593 四个基因表达水平显著高于SM25175和SM18（p<0.05）。结果提示dlt操纵子在 S. mutans生物膜形成过程中起着重要的调控作用。在本研究中发现，dltD在SM 593中显著高表达于另两个菌株（p<0.05）。通过同源重组的方式，本研究成功构建了SM593、SM18及SMUA159 dltD基因缺失株。dltD基因敲除后，SM593、SM18及SM UA159生长特性发生了一定改变，细菌链长增长且易发生沉积。结晶紫染色实验发现dltD基因敲除后，SM593、SM18及SMUA159敲除株较原始株所形成生物膜明显减少（p<0.05），且SMUA159、SM18生物膜的改变量较SM593更大，表明dltD基因缺失对SMUA159、SM18形成生物膜能力的影响较SM593更大。浮游菌耐酸实验结果可知：dltD基因敲除后，SM 593、SM 18及SM UA159在浮游状态下耐酸能力有所下降 (p<0.05)，相较于SMUA159和SM18，SM593下降程度更大，表明dltD基因缺失对SM593耐酸能力的影响较SMUA159和SM18大。由此表明dltD基因对 S. mutans的生物膜形成能力和耐酸性具有极其重要的作用。