筛选神经发育和神经干细胞微环境中血管细胞粘附分子VCAM-1的相互作用分子的研究

Understanding the mechanisms of neural development would help us understand the pathogenesis of developmental brain disorders and neurodegenerative diseases. Vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) is a cell adhesion molecule expressed on the membrane surface of activated vascular endothelial cells. When binding with surface receptor VLA4 (α4 integrin) of leukocyte, VCAM-1 would mediate endothelial cell deformation and leukocyte migration. In the central nervous system, neural stem cells and progenitor cells are situated in the developing ventricular zone (VZ) and subventricular zone (SVZ), and a subset of Type B astrocytes continue to produce neurons in the adult SVZ lining the striatal side of the lateral ventricle. Our previous study found that VCAM-1 is highly expressed in the developing ventricular zone of the forebrain and a subset of Type B cells in the SVZ in the adult neurogenic niche. The expression of VCAM-1 gradually decreases as the number of neural progenitor cells decrease during development but persists in adult SVZ niche, indicating VCAM-1 expression pattern is highly correlated with development of neural stem cells. Knocking down of endogenous VCAM-1 with shRNA in neural stem cells leads to suppressed self-renewal in neurosphere assay, suggesting VCAM-1 plays an important role in neural stem cell function. However it is not clear what mechanisms mediate VCAM-1 function. In this study we will test the hypothesis that other VCAM-1 interacting molecules are present in the developing ventricular zone and in the adult SVZ niche, based on the preliminary result that VCAM-1 receptor VLA4 was not detected there. We plan to screen for molecules that interact with VCAM-1 through co-immunoprecipitation using tissue of embryonic brain and adult SVZ and further proteomics analysis.This project will help us identify novel signaling pathways for VCAM-1 in the brain and understand the mechanisms underlie neural stem cell development.

理解大脑的正常发育机制有助于我们理解先天发育性神经疾病和神经退行性疾病的发病机制。血管细胞粘附分子VCAM-1是一种表达在激活的血管内皮细胞表面，介导白细胞粘附的分子。我们前期研究发现VCAM-1表达在发育大脑的脑室区和脑室下区。在成年小鼠大脑，VCAM-1只表达在SVZ区的细胞中。VCAM-1的这种特定的细胞表达模式与神经干细胞的表达模式高度一致。运用RNA干扰技术敲减内源性VCAM-1，我们发现神经干细胞的自我更新被抑制。由于小鼠神经发育过程中没有检测到VCAM-1受体VLA4的表达，因此我们推测，在神经发育和成年SVZ区，还存在其他与VCAM-1相互作用分子。本项目拟通过对发育过程和成年大脑SVZ区的组织进行免疫共沉淀，结合蛋白质组学分析技术，筛选出与VCAM-1相互作用的分子，并进行验证。对VCAM-1在神经干细胞发育或神经干细胞微环境中的信号传导通路进行深入研究。

神经干细胞（NSCs）具有自我更新和分化成不同类型神经细胞的潜能。对神经干细胞的鉴定，对神经干细胞发育与分化的内在调控机制及神经干细胞微环境的研究，将增进对神经系统发育过程，以及发育障碍性脑疾病发病机制的理解。血管细胞粘附分子VCAM1是一种表达在激活的血管内皮细胞表面，介导淋巴细胞粘附的分子。而我们前期研究发现 VCAM1在发育中的小鼠大脑的脑室区和脑室下区的细胞中有较多表达。在成年小鼠大脑中，VCAM1 只表达在 SVZ 区的细胞中。VCAM1的这种特定的细胞表达模式与神经干细胞的分布模式高度一致。运用RNA干扰技术敲减内源性VCAM1，我们发现神经干细胞的自我更新被抑制。由于在小鼠神经发育过程中没有检测到VCAM1 受体VLA4的表达，因此我们推测，在神经发育和成年SVZ区，还存在其他与 VCAM1 相互作用分子。.本项目利用免疫荧光以及慢病毒介导的内源性蛋白分子敲减和过表达技术，免疫共沉淀技术，电泳和质谱技术，明确了 VCAM1 在神经干细胞发育及成年大脑中分布的细胞类型，系统地分析了胚胎发育过程中以及成年大脑SVZ区中可能与VCAM1相互作用的蛋白质分子，及其在神经干细胞微环境中的功能和下游信号通路。我们发现，VCAM1主要表达在一类神经干细胞亚群中，以VCAM1为表达标志的神经干细胞群要比以Nestin，Pax6，Lex或Sox2等蛋白为标志的神经干细胞群的数量更少。根据这些特点，我们认为VCAM1可以作为一类神经干细胞亚群的细胞膜表面标志蛋白。我们还发现，VCAM1的表达对于神经干细胞干性的维持具有重要作用，敲除VCAM1可以降低神经干细胞在体的增值能力，从而影响成年后大脑SVZ区神经干细胞的数量。而且，我们发现VCAM1主要通过胞内段抑制GSK3β 的活性，从而提高β -catenin 的转录活性，维持细胞的增殖状态。.综上所述，我们可以运用VCAM1这个特异性标记一类神经干细胞亚群的新的细胞表面标志物，纯化和富集活的神经干细胞，从而突破了活的神经干细胞难以分离的研究瓶颈。我们的研究揭示了神经干细胞干性维持的新机制，无论是对于神经干细胞自身发育机制研究，还是神经干细胞与微环境之间的相互作用的研究都具有重要意义，为神经干细胞在基础和临床中的运用提供了理论基础。