LncRNA SRA1在ER阳性乳腺癌新辅助化疗耐药中的表达及调控耐药机制研究

Multidrug resistance is an important reason for the recurrence and metastasis during the neoadjuvant chemotherapy of ER+(Estrogen Receptor positive) breast cancer. Screening of molecular markers and regulators in this process is important for monitoring/ reversing drug resistance. We used reversal agents to reverse the high-resistance MCF7/ADR cells(ER+), and then evaluate the change of 17 candidate LncRNA expression.The results show LncRNA SRA1 was significantly decreased in the reversed MCF7/ADR cells compared to high resistance cells,and using siRNA-LncRNA SRA1 can remarkablely increase the sensitivity of MCF7/ADR cells to adriamycin. We believe that this LncRNA, which is screened out of the dynamic changes before and after the reversal, is more closely related to the development of multidrug resistance than the screening of sensitive strains/resistant strains. Therefore,in this study we will use the organization and serum samples, to clearify the coralation of LncRNA SRA1 and the neoadjuvant chemotherapy-induced resistance in ER+ breast cancer; Second, to explore how the “LncRAN SRA1→hsa-let-7c→ERα/ERβ→Ras/MAPK pathway→multidrug resistance” move on. Therefore, we can explore the molecular mechanism of its regulation of multidrug resistance, and provide important research and clinical reference to early diagnosis and reversal strategy of the neoadjuvant chemotherapy-induced multidrug resistance of ER+ breast cancer.

乳腺癌新辅助化疗中ER阳性患者更易发生多药耐药导致不良预后，寻找关键调控分子是监控/逆转耐药的重要途径。我们对ER+乳腺癌耐药株进行逆转剂干预，比较17个乳腺癌相关LncRNA在逆转前后动态变化，发现：LncRNA SRA1在耐药株MCF7/ADR中高表达，逆转剂干预后其表达下降；siRNA-SRA1直接作用耐药株后，发现其对阿霉素的敏感性显著增加，说明LncRNA SRA1与ER+乳腺癌耐药的发生密切相关。因此，拟首先通过组织/血清样本，明确LncRNA SRA1与ER+乳腺癌新辅助化疗耐药发生发展的相关性；其次通过分子生物学和动物模型等手段，探讨“LncRAN SRA1→hsa-let-7c→ERα/ERβ→Ras/MAPK通路→耐药”，回答其调控耐药的分子机制，以期为ER+乳腺癌新辅助化疗多药耐药早期诊断和逆转提供重要的科研认识和临床参考。

本项目从ER+乳腺癌密切相关的LncRNAs出发，通过比较耐药逆转剂作用前、后的LncRNAs的变化，筛选出了与耐药分子事件密切相关的LncRNA SRA1，进一步对LncRNA SRA1在ER+乳腺癌患者中的表达以及诱导耐药的机制做了深入研究。. 研究首先发现了降低LncRNA SRA1在MCF-7/ADR中表达后，MCF-7/ADR细胞对阿霉素敏感性增加，形态学变化明显，细胞增殖明显受到抑制，凋亡率显著高于阴性对照组（P<0.05）。 随即，在组织水平，我们研究了ER+乳腺癌行TCA方案的患者中，耐药/敏感患者LncRNA SRA1的表达，发现在耐药患者中LncRNA SRA1明显高表达（P<0.05）；其次，在细胞水平，降低LncRNA SRA1表达后，MCF-7/ADR细胞对阿霉素敏感性增加，形态学变化明显，细胞增殖明显受到抑制，凋亡率显著高于阴性对照组（P<0.05）； 降低LncRNA SRA1表达，显著抑制了乳腺癌MCF-7/ADR 细胞增殖、迁移和侵袭能力，并且出现细胞周期的S期阻滞（P<0.05）；此外，耐药相关基因ABCB1（p-gp）、雌激素相关基因ER-a在RNA水平表达下调，而ER-β表达上调（P<0.05）；蛋白水平研究显示，耐药关键蛋白P-gp表达下调，MAPK/Erk1/2磷酸化受抑制，MAPK/SAPK/JUK信号通路磷酸化被激活。通过RNA-seq二代测序分析结果显示：降低MCF-7/ADR细胞中LncRNA SRA1表达后，差异表达基因共174个。其中，高表达30个，低表达的144个。KEGG及GO功能分析显示，上述差异表达的基因主要与细胞分裂、细胞增殖及细胞内新陈代谢功能有关。差异基因还与类固醇激素合成及糖代谢等信号通路密切相关。最后我们还进行了RNA pull-down和质谱检测，鉴定了和LncRNA SRA1相互结合的蛋白，发现SPTBN1家族、SOX9家族等耐药相关蛋白与其存在相互作用。. 综上，本研究发现LncRNA SRA1低表达能增加乳腺癌MCF-7/ADR对阿霉素敏感性，其可通过ER-a/ER-β/Erk1/2/SAPK/JUK/MAPK信号通路调控耐药相关蛋白P-gp表达，进而调控耐药，可为耐药监测试剂盒的研发及耐药发生的机制探索提供前期基础。