基于支持细胞线粒体自噬途径研究五子衍宗丸改善生精功能机理

Wuziyanzong pill ,the classical formula of supplementing kidney essence method ,is effective in the treatment of male infertility. Our preliminary study showed that Wuziyanzong pill improved sertoli cell secretory function and spermatogenesis.Mitochondria，the primary energy-generating organelle, is known to play the vital role in regulating secretory function of sertoli cell and the target organelle of Wuziyanzong pill. Also, mitochondrial homeostasis and proper cell function are regulated by mitophagy, a process by which damaged mitochondria are subjected to autophagic degradation. Regarding the sertoli cell mitophagy as the breakthrough point and significant relationship of "mitophagy-mitochondrial function-secretory function- spermatogenesis", it is postulated that the improvement of sertoli cell secretory function and spermatogenesis by Wuziyanzong pill can be regulated through mitophagy. With the method of cell biology, molecular biology and serum pharmacology, the change of sertoli cell mitophagy,mitochondrial function, secretory function and spermatogenesis are to be observed both in vivo and in vitro. The present study is of great significance in elucidating the mechanisms involved in improvement of spermatogenesis by supplementing kidney essence and regulating sertoli cell function through mitophagy.

五子衍宗丸是补肾益精法治疗男性不育的经典方，线粒体是五子衍宗丸作用的靶细胞器。前期研究表明五子衍宗丸可通过改善睾丸支持细胞分泌功能进而改善生精功能。线粒体在支持细胞分泌功能中发挥重要调控作用，而线粒体数量及功能主要通过"线粒体自噬"方式调节。本课题以"支持细胞线粒体自噬调控"为切入点，依据"线粒体自噬调控-线粒体功能-支持细胞分泌功能-生精功能" 密切关联为理论基础，提出"线粒体自噬途径在支持细胞分泌功能调控中发挥重要作用，五子衍宗丸可通过调控支持细胞线粒体自噬改善支持细胞分泌功能，进而改善生精功能"的假说。本研究采用五子衍宗丸对肾精亏虚证生精障碍大鼠模型、原代培养大鼠支持细胞和TM4小鼠支持细胞系进行干预，通过细胞、分子生物学和血清药理学等方法观察线粒体自噬、线粒体功能、支持细胞分泌产物及生精功能的变化，对从支持细胞"线粒体自噬"途径揭示补肾益精法改善生精功能机理具有重要意义。

五子衍宗丸是中医治疗男性不育的代表方。该法如何通过改善支持细胞线粒体自噬而进一步改善生精功能还所知甚少。我们通过离体和在体实验观察了五子衍宗丸干预后支持细胞线粒体功能、自噬标记物蛋白表达、超微结构、支持细胞分泌功能及生精功能变化。研究显示：（1）离体实验：构建大鼠Cox7a2重组质粒及小鼠Cox7a2慢病毒载体。大鼠原代支持细胞：和正常细胞相比，转染重组质粒后支持细胞活性氧水平和自噬标记物蛋白（LC3、Beclin-1）表达显著增高。超微结构提示：支持细胞内自噬泡增多，自噬泡包围损伤及形态异常的线粒体，正常形态线粒体数量减少。加入自噬抑制剂（3-甲基腺嘌呤，3-MA）或自噬激动剂（雷帕霉素）后上述结果均呈现减弱或增强趋势。小鼠TM4支持细胞系：与正常细胞相比，转染Cox7a2慢病毒细胞中活性氧水平升高，自噬标记物蛋白（LC3、Beclin-1）表达降低，支持细胞分泌产物(转铁蛋白、血清抑制素B)水平下降；给予五子衍宗丸含药血清共培养后，转染慢病毒组升高的活性氧水平降低，降低的自噬标记物蛋白表达和支持细胞分泌产物水平升高。（2）在体实验：通过构建肾精亏虚证生精障碍大鼠发现：其支持细胞分泌产物表达发生显著变化，睾丸生精功能(精子浓度、活力、总数)显著下降，睾丸组织支持细胞自噬标记物蛋白LC3、LAMP-2表达和线粒体自噬标记物LC3阳性颗粒显著降低。五子衍宗丸干预后睾丸生精改善，支持细胞LC3、LAMP-2表达和LC3阳性颗粒增加，支持细胞分泌产物显著变化。本研究揭示了五子衍宗丸改善生精功能的机理与其调控支持细胞线粒体自噬通路有关。