半滑舌鳎microRNA表达谱构建与免疫相关性分析

microRNA(miRNA)是重要的基因表达调控因子，在哺乳动物免疫调控中具有核心作用。为回答miRNA对鱼类免疫调控的机制尚不清晰这一科学问题，本研究以半滑舌鳎为研究对象，开展基于高通量测序的小RNA、转录组、miRNA-mRNA降解组的生物信息分析、miRNA/靶基因定量表达和功能分析研究。构建与免疫应答海水鱼类重要致病菌相关的细致全貌的miRNA和转录组差异表达谱，获得差异显著的miRNA及预测靶基因；确立鳗弧菌感染前后miRNA的组织时空表达模式及miRNA/靶基因表达的相关性；初步阐明miRNA的功能及对疫靶基因的免疫调控方式，发现miRNA与免疫应答相关的证据。本研究有望充实鱼类免疫功能基因组学和基础免疫的理论基础，对全面了解鱼类免疫系统的分子组成及深入认识鱼类免疫调控及免疫御机制具有理论意义，为抗病品种培育和分子抗病策略制定提供科学依据和基因资源。

半滑舌鳎是重要的经济养殖鱼类，但养殖受到各种病原的严重威胁，因此从分子层面探究其免疫机理，将为其病害防治提供理论基础。miRNA在免疫调控和免疫细胞的发育中扮演着重要角色，参与了固有性免疫应答。本项目构建了3个半滑舌鳎混合免疫组织（肝脏、肠、脾脏和头肾）小RNA文库：注射PBS对照组CG、感染鳗弧菌后无明显症状组NOSG和有明显症状组HOSG，进行了高通量测序，分析鉴定得到了452种miRNA；发现了24种新的miRNAs。采用实时定量PCR，验证了其中10种miRNAs的表达情况与测序结果在差异倍数和3个小RNA文库表达趋势上基本一致；定制了1279条miRNA探针进行基因芯片检测，获得了99种差异表达的miRNA， 通过qRT-PCR的方法验证了10种miRNA的表达情况与芯片结果在差异倍数和表达趋势上基本一致；对99种差异表达的miRNA进行靶基因预测，并进行GO富集和KEGG通路分析，获得了半滑舌鳎可能的免疫相关miRNA及其靶基因；其中5个miRNA（miR-221, 222, 223, 722和727）通过PCR的方法进行了前体克隆，利用qRT-PCR的方法分析了其在健康组织、感染后不同时间点的免疫组织和4种病原模拟物处理的头肾细胞和肝脏细胞中的表达情况，结果表明miRNA前体具有典型的茎环结构，miRNA在不同的组织中均有表达，能对病原刺激产生免疫应答，确实了这些miRNA在半滑舌鳎免疫应答中发挥了重要作用；利用PCR方法对miR-722、miR-727可能靶基因C5aR1、C6进行了克隆，构建了3’UTR的双荧光表达载体，通过脂质体方法在半滑舌鳎肝脏细胞和人胚肾细胞中进行了转染实验，通过双荧光素检测和实时定量检测，证实了miR-722、miR-727的靶基因分别是C5aR1、C6，这是首次关于鱼类miRNA调控重要免疫基因的实验结果。本研究获得了半滑舌鳎免疫相关miRNA，分析了其在不同病原刺激下的免疫应答机制，为半滑舌鳎miRNA参与免疫调控提供了理论基础，已完成申请书中的全部任务。已发表6篇SCI和1篇中文核心期刊文章，另有2篇文章在撰写中，拟投稿SCI 刊物。培养博士研究生1名，硕士研究生3名，2名毕业，1名在读。1人获得2014-2015年度中华农业优秀创新团队(位2，等同于创新成果一等奖)，另外申请人获青岛市南区第五届专业技术拔尖人才称号。