TRADD基因慢病毒涂层食管支架的构建及其抗支架术后再狭窄的实验研究

支架置入术是治疗食管狭窄的主要手段。但支架置入后组织成纤维细胞增生、纤维化、最终导致再次狭窄是影响其疗效的最主要原因。控制两端组织增生是支架治疗成败的关键。前期及其它研究均发现增生性瘢痕成纤维细胞TRADD表达明显减少，导致细胞凋亡率下降，反之,提高TRADD表达可提高TNF介导的细胞凋亡。因此,我们推测将TRADD基因整合进宿主细胞基因组中以提高TRADD表达，可能抑制食管支架造成的食管组织增生，进而减少支架术后再狭窄发生。本课题拟采用氩气刀处理制备食管良性狭窄动物模型,取增生性瘢痕组织培养成纤维细胞，构建TRADD基因慢病毒载体并转染细胞,体外观察TRADD对增生性瘢痕成纤维细胞的选择性介导凋亡作用；采用涂层技术将TRADD慢病毒载体及TNF涂附在食管支架上，将支架置于食管狭窄段，观察支架两端组织增生的抑制效果并探讨其机制。以期为基因抗增生食管支架用于食管良性狭窄治疗提供理论依据。

研究背景：食管支架置入术后再狭窄的发病率高，严重影响了支架的应用，成为临床工作中的难点。再狭窄的主要原因是成纤维细胞的活化与过度增殖，导致肉芽组织增生及纤维化的发生。在细胞凋亡的相关信号通路中，死亡受体介导的信号通路是其主要途径之一。其中，肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白（TRADD）在TNF-α介导的细胞凋亡信号通路中发挥着重要作用。前期研究发现增生性瘢痕成纤维细胞TRADD表达明显减少，导致细胞凋亡率下降，我们推测通过提高增生性瘢痕成纤维细胞中TRADD的表达量可达到促进其凋亡的作用。研究内容：构建具有生物活性的TRADD基因慢病毒，转染至胚胎成纤维细胞及增生性瘢痕成纤维细胞中，检测其对细胞增殖与凋亡，细胞分裂，Ｉ型胶原蛋白分泌的影响。同时，我们以家犬为实验动物，研究APC不同输出功率、氩气流量及作用时间与食管损伤程度之间的关系，探讨食管组织损伤与瘢痕增生及食管狭窄之间的关系，并建立食管良性狭窄动物模型。局部注射TRADD基因慢病毒于动物皮肤瘢痕和食管瘢痕狭窄处，观察瘢痕狭窄情况。采用物理涂层的方法分别将曲安奈德、紫杉醇及TRADD慢病毒涂附在食管支架上，制备曲安奈德、紫杉醇及TRADD慢病毒涂层抗增殖食管支架，将其置于动物食管良性狭窄段，观察其抗食管再狭窄的作用。主要结果：TRADD慢病毒单独及联合10ng/ml TNF-α均能选择性抑制HSFb的增殖，对EFb无抑制作用。TRADD慢病毒引起HSFb G2/M期阻滞，10ng/ml TNF-α可有效促进该阻滞作用的发生，TRADD慢病毒联合10ng/ml TNF-α引起HSFb亚G1凋亡峰的出现，而TRADD慢病毒、10ng/ml TNF-α对EFb细胞周期及凋亡均无明显影响。TRADD基因慢病毒单独及联合10ng/ml TNF-α在24h、48h、72h均可抑制HSFbⅠ型胶原蛋白的分泌，对EFb无抑制作用。实验结果显示氩气流量为2L/min、功率为70W、作用时间为3s时，可成功制备食管良性狭窄动物模型。注射TRADD基因慢病毒于动物皮肤瘢痕和食管瘢痕狭窄处，可长期表达，并有效抑制瘢痕增生。成功制备曲安奈德及紫杉醇涂层抗增殖食管支架，对食管良性狭窄有明显抗增生作用。成功将TRADD基因慢病毒载体涂附在食管支架上，将涂层支架置于动物食管良性狭窄段，TRADD基因可在食管组织中表达，并明显减轻支架两端组织增生。