新型生物催化剂Perakine还原酶复合物结构解析及其在抗肿瘤吲哚生物碱构建的应用

The employment of enzymes serving as a biocatalyst for the natural drug synthesis with chemical difficulties synthesis is highly efficient and enviromentally friendly,which represents one of the hotspots of "green chemistry".Perakine reductase is a key enzyme involved in the indole alkaloids biosynethsis of the medicinal plant Rauvolfia sepentina. With its relatively board substrate specificity and high heterologous expression in Escherichia coli, PR is a potential biocatalyst for drug synthesis. The 3D-structures of PR and its complex with cofactor NADPH have been recently reported by the applicant. To further clarify binding site and catalytic mechanism, crystallization and X-ray three dimensional structure elucidation of PR-cofactor-substrate ternary complexes will be performed in this project. Further more, three dimensional-structure based enzyme engineering, substrate (indole alkaloids) specificity improvement,and the comparisons of the anti-tumor activity of new substrates and products will be carried out to develop PR as a novel biocatalyst.

酶作为生物催化剂应用于结构复杂的天然药物的合成具有高效、环保的特点，是"绿色化学"倡导的热点之一。Perakine还原酶（PR）为药用植物蛇根木吲哚生物碱次生代谢关键酶，以生物碱Perakine为天然底物。PR底物谱广，大肠杆菌异源表达量高，具备生物催化剂的基本特性，我们前期研究已解析了该酶游离态及其与辅酶二元复合物的三维结构。在此基础上，本项目拟通过制备不同PR-辅酶-底物三元复合物晶体，以大分子晶体X-ray衍射学方法解析复合物三维结构，确定PR的底物结合位点、结合方式，阐明催化机理，并据此对该酶进行合理酶工程设计，运用定点突变改造其底物结合位点，改良底物特异性，包括扩大其吲哚生物碱底物谱、提高催化效率，并比较转化前后吲哚生物碱的抗肿瘤活性，为PR成为新型生物催化剂奠定理论基础。

仿生-化学联用高效合成结构复杂药物长期以来都是化学研究的热点之一。Perakine还原酶（PR）是蛇根木吲哚类生物碱生物合成关键酶，以NADPH为辅酶，将生物碱Perakine的醛基还原为醇羟基。PR底物谱宽泛，异源表达量高，具备生物催化剂的基本特性。本项目旨在通过系统的结构生物学研究，揭示PR的辅酶和底物结合机理，为理性改良PR催化性能成为新型生物催化剂提供理论基础。针对NADPH的烟酰环和核糖部分与蛋白结合弱，造成该部分结构缺失的情况，设计了增强结合力的E157和M21位的定点突变，筛选并优化了各突变体与NADPH复合物的结晶条件，但X-ray三维结构解析后发现，E157和M21位突变仍无法使烟酰环和核糖与蛋白牢固结合；针对已有PR-NADPH复合物晶体结构中底物结合位点为相邻对称分子的F92残基所占据，将F92突变为侧链较小的丙氨酸或敲除，释放底物结合位点，筛选并优化突变体-辅酶-底物三元复合物结晶条件，目前已获得F92A突变体与NADPH及底物4-硝基苯甲醛复合物晶体。为使PR能应用于化学合成难度大的不对称醇的仿生合成，根据PR醛类底物骨架筛选PR酮类底物，在所测试的30个酮类化合物中，其中13个具有活性，其中4-硝基苯乙酮活性最强，测定了该化合物的催化动力学参数；NADPH价格昂贵，为降低PR仿生应用的成本，进行了辅酶替代物的筛选，成功筛选到3种合成相对简单可用于PR催化反应的化合物，为阐明辅酶替代物与PR的结合，我们筛选并优化了PR与辅酶替代物的共结晶，解析晶体X-ray三维结构发现替代物并未与PR结合形成复合物。本项目将PR的底物谱拓展至酮类化合物，且NADPH替代物的发现大大降低了PR仿生合成的成本，为PR应用于不对称醇的仿生合成解决了两个关键性问题。