新型N-糖苷酶PNGase F-Ⅱ功能及催化机制的研究

Protein glycosylation and deglycosylation of glycoproteins are two important biological reactions. Although studies have shown that glycosylation is associated with cancer, infections and immune diseases, research on deglycosylation is still underway for the limited technology and methods. Deglycosylation is mainly mediated through Peptide:N-glycosidase (PNGase), which cut intact asparagine-linked oligosaccharide chains from N-glycoproteins. PNGase is playing a key role in biological process (such as human PNGase (NGLY1)) and in glycobiology research as well (PNGase F). However, one common limitation of both NGLY1 and PNGase F is insensitive to glycans with core α-1,3 fucose on N-glycoprotein. Recently, we identified a novel PNGase from a clinical isolate of Elizabethkingia meningoseptica that could cleave the intact asparagine-linked oligosaccharide chains from core α-1,3 fucosylated N-glycoprotein (Published in JBC, 2015, Patent Application No. 201410134277.3). It was named as PNGase F-Ⅱor type 2 PNGase F. As a continuation of the previous work, we plan to illustrate the crystal structure of PNGase F-Ⅱ/substrate complex, and to identify the active sites of the enzyme. The study will establish the mechanism for its action and regulation, and to provide an alternative tool with a unique feature for the understandings of the deglycosylation of N-glycoproteins with core α-1,3 fucose.

蛋白糖基化和糖蛋白去糖基化是互相关联的生物学过程，已知糖基化与肿瘤、感染和免疫疾病相关，但受研究方法和技术手段限制，糖蛋白去糖基化的研究尚在起步中。去糖基化主要由糖苷酶介导，其中N-糖苷酶水解N-糖蛋白释放完整糖链，既是重要的功能酶，如人N-糖苷酶NGLY1与神经病变和智力障碍相关，也是重要的工具酶，如PNGase F用于N-糖蛋白结构和功能研究，但这两个酶对有核心α-1,3岩藻糖N-糖蛋白不敏感。我们前期在脑膜炎败血伊丽莎白金菌中发现了一种新型N-糖苷酶，对核心α-1,3岩藻糖N-糖蛋白有去糖基化作用，解析了晶体结构，命名为Ⅱ型 N-糖苷酶PNGase F-Ⅱ(发表于JBC，2015)。本项目采用质谱分析和共结晶技术，拟开展PNGase F-Ⅱ底物的特征性分析、酶活性位点及PNGase F-Ⅱ/底物复合物晶体结构的研究，以阐明该酶的催化机制，为核心α-1,3岩藻糖的糖生物学研究奠定基础。

糖基化及去糖基化对糖蛋白结构与功能有着重要的作用。蛋白糖基化和糖蛋白去糖基化是互相关联的生物学过程，已知糖基化与肿瘤、感染和免疫疾病相关，但受研究方法和技术手段限制，糖蛋白去糖基化的研究尚在起步中。早期发现的PNGase F可以用于N-糖蛋白结构和功能的研究，但该酶对有核心α-1,3岩藻糖N-糖蛋白不敏感。本课题组前期在脑膜炎败血伊丽莎白金菌中，发现一种新型N-糖苷酶PNGase F-Ⅱ，该酶不仅能水解不同糖型的N-糖肽或N-糖蛋白的寡糖，还能对核心α-1,3岩藻糖修饰的N-糖蛋白有去糖基化作用，释放完整的N-寡糖链，同时Asn变为Asp。本项目通过基因突变、质谱及结晶等方法，对PNGase F-Ⅱ的底物谱、活性位点及结构进行了深入研究，初步阐述了该酶的底物范围及催化机制。首先，分析PNGase F-Ⅱ的底物特征及结构。该酶的底物范围较广，包括动物来源的无核心岩藻糖和含核心α-1,6岩藻糖N-糖蛋白、植物来源和昆虫来源的含核心α-1,3岩藻糖且有典型核心五糖结构（Man3GlcNAc2）结构的N-糖蛋白。但是，该酶对含核心α-1,3岩藻糖修饰的非典型核心五糖的N-糖蛋白，没有去糖基化作用。其次，通过定点突变和截短突变，明确了该酶的活性位点。PNGase F-Ⅱ的主要活性位点为Asp-245、Gly-350、Glu-435、His-427，其中Asp-245、Gly-350和Glu-435突变可影响其催化活性；His-427突变，该酶对核心α-1,3岩藻糖N-糖蛋白的去糖基化作用丧失，但对无核心岩藻糖和α-1,6核心岩藻糖修饰的N-糖蛋白无影响，His-427可影响PNGase F-Ⅱ的底物特异性。第三，依据解析的PNGase F-Ⅱ晶体结构，构建了PNGase F-Ⅱ与底物形成复合物的模拟结构。与PNGase F相比，PNGase F-Ⅱ活性中心的空间结构较大，帮助解释PNGase F-Ⅱ的底物范围比PNGase F更广。本项目研究的PNGase F-II，不仅具有PNGase F的功能，还能对核心α-1,3岩藻糖修饰的N-糖蛋白有去糖基化作用，为一种新型N-糖苷酶，为糖生物学研究工具提供了必要补充。