拟南芥芥子酶“假基因”TGG6活性等位基因的功能研究

糖苷化合物是植物重要次生代谢产物，具有抗旱、抗病虫、调控生长发育等多种功能。硫代葡糖苷是白化菜目植物特有的糖苷化合物，在植物受到病虫侵害时，芥子酶将硫代葡糖苷降解为有毒化合物，起防御作用。拟南芥TGG6是我们发现的新型芥子酶基因家族成员，曾被认为是假基因，但在花粉中特异表达。通过筛选生态型，我们发现了TGG6活性等位基因，克隆表达了其cDNA。重组蛋白不能降解其它芥子酶都能降解的硫苷sinigrin，却能降解O-β-葡糖糖苷，因此TGG6有特殊的底物要求，其功能可能不同于其它芥子酶基因。本项目拟在前期工作基础上，通过对活性等位基因编码蛋白的底物特异性、活性等位基因对拟南芥糖苷代谢组及表型的影响、活性和失活等位基因表达调控差异等几个方面的研究，探索TGG6活性等位基因的生物功能及在大多数生态型中被失活的原因。本项目对理解芥子酶基因起源进化及功能多样性，以及对十字花科作物遗传育种具有较大意义。

硫代葡萄糖苷是白花菜目植物特有的糖苷化合物，被白花菜目植物特有的芥子酶(硫代葡萄糖苷酶)所降解。芥子酶和硫代葡萄糖苷分别储存在不同的细胞，或者同一细胞不同部位，在植物体受到害虫或病菌侵害时，芥子酶将硫代葡萄糖苷降解为有毒化合物，抵御病虫侵害。这就是所谓的“芥子炸弹”。因此，植物芥子酶基因的生物功能主要是防御。我们的研究表明，与拟南芥TGG6基因同属于一个芥子酶基因亚家族的TGG4、TGG5的酵母表达产物具有芥子酶的典型酶学特性，在拟南芥中的表达部位位于根尖分生区，具有调节生长发育的作用。TGG6在基因序列上与TGG4和TGG5高度相似，但是在几个被测试生态型中具有数个移码突变，一度被认为是假基因，然而，该基因却在花中特异表达。通过对28个生态型的筛选，我们在Ty-0等9个生态型中发现了TGG6的活性等位基因。其它19个生态型中的TGG6基因都由于移码突变而失活。共有13个移码突变类型，发生在不同的核苷酸位点，说明TGG6的失活通过多次独立突变完成，大自然倾向于保留TGG6失活的生态型。克隆了TGG6活性等位基因cDNA,在酵母和细菌中表达，产物蛋白不能降解sinigrin，而能降解4-pNPG，说明TGG6可能是进化早期的芥子酶。用RT-PCR方法研究了TGG6活性等位基因和失活等位基因的表达差异。结果表明，两类植株中TGG6 基因的表达模式基本相同，都只在花中特异表达。分别用活性等位基因和失活等位基因的启动子驱动GUS基因的表达，两类基因的表达模式也基本一致，都只在花粉中表达。不过，活性等位基因表达的时间早一点，在刚露白花的花粉中就有比较强的表达，而失活等位基因在未开放的花朵中不表达。为了研究活性等位基因TGG6的功能，构建了Ty-0全长基因（包括启动子和全长编码区）的植物表达载体，通过农杆菌介导转化拟南芥Col-0（具失活等位基因）。转基因植株的叶片比Col-0大，植株也高于对照，抽薹时间比对照推迟5天，但最终单株果荚数高于对照。在种子成熟期，转基因植株的种子成熟速度要快于野生型。由此可以推测，TGG6活性等位基因具有促进植株营养生长、推迟开花和提高种子产量的作用。本项目获得海南省科技进步奖二等奖一项，中华农业科技进步奖三等奖1项。获得授权发明专利1项。已发表学术论文4篇，待发2篇。培养毕业硕士研究生4名。