En-2对肾透明细胞癌细胞生物学行为的影响及分化调控机制的研究

The pathogenic mechanisms of clear cell renal cell carcinoma (CCRCC) remain unknown. We have investigated the expression status of the Engrailed 2 (En-2) gene in CCRCC tissues and cell lines in comparison to normal renal tissues and cells and found that in contrast to normal renal cells, EN2 is down-regulated and ectopically expressed in CCRCC. Furthermore, expression of EN2 was negatively correlated with the histological grade of CCRCC tumors. Based on these observations, We prepare to study the effect of En-2 over-epression and knockdown on proliferation, apoptosis and invasion of human CCRCC and normal renal cell line respectively, Furthermore, to confirm the effect in tumor-bearing mouse model.Promoter methylation status of En-2 will be explored by methylation-specific PCR and identified methylation sites by sequencing, furthermore, to study the expression of EN2 protein after demethylation. Expression of the Wnt signaling pathway molecules will be detected post En-2 over-epression and knockdown by qRT-PCR and Western Blot to study the molecular mechanisms of En-2 effects on proliferation and apoptosis of CCRCC cells. The study will reveal the pathogenesis and provide new therapeutic strategy for detection and treatment of CCRCC.

肾细胞癌发病机制尚未明确。本项目组前期研究发现EN2(Engrailed-2)蛋白在肾透明细胞癌中存在表达缺失现象，且EN2蛋白表达水平与肾透明细胞癌分化呈负相关。本项目研究拟通过质粒构建及基因转染技术，使人肾透明细胞癌细胞株过表达En-2基因及敲除人肾小管上皮细胞株内源性En-2基因，分别观察上述细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为变化，并在荷瘤鼠模型中加以验证；通过甲基化特异性PCR等技术检测肾透明细胞癌中En-2基因的启动子甲基化情况，通过测序确定其甲基化位点，并检测去甲基化后EN2蛋白表达恢复情况；通过Western Blot及PCR技术检测En-2基因过表达和敲除后Wnt信号通路相关效应分子的表达，探寻En-2影响肾透明细胞癌分化的相关信号通路，进一步探讨肾透明细胞癌发病的分子机制，为肾透明细胞癌的诊治提供新思路。

肾癌是常见的泌尿系肿瘤，近年发病率呈上升趋势。肾癌起病隐匿，约30%的肾癌患者在确诊时已出现远处转移。肾癌是多基因相关肿瘤，发病机制极为复杂，病程发生、发展的分子生物学基础迄今尚未完全阐明。En-2 作为转录因子在转录水平起调节作用，在胚胎期对于神经系统发育起着重要的作用。En-2 基因在成人期的多种恶性肿瘤异常表达。本项目组前期研究结果表明EN2 蛋白在肾近曲小管及远曲小管中表达增高，主要见于肾近曲和远曲小管上皮胞浆内及部分细胞核，而在肾透明细胞癌中呈低水平异位表达，EN2 在肾透明细胞癌中的表达水平与肿瘤分化成负相关。. 在前期研究的基础上，课题组探讨了分别高表达人肾透明细胞癌细胞En-2基因及沉默人肾小管上皮细胞En-2基因后对应细胞生物行为的影响，结果显示：人肾透明细胞癌细胞786-O在成功转染pcDNA3.1+EN2真核表达质粒后，细胞增殖活性减低，EN2过表达可诱导细胞细胞凋亡。并降低了人透明细胞癌细胞株786-O细胞的侵袭能力。据此，推断En-2 基因在肾透明细胞癌可能具有抑癌基因的功能。. 研究第二阶段探讨了肾透明细胞癌中EN2基因启动子区甲基化情况及其对肿瘤的影响，结果显示肾透明细胞癌中EN2基因存在高甲基化现象，786-O细胞EN2基因甲基化程度能被5-Aza-dc减弱，并且5-Aza-dc处理后EN2表达水平得到恢复， 5-Aza-dc通过去甲基化作用增加786-O 细胞凋亡、抑制细胞增殖及降低细胞的侵袭转移能力。研究还发现肾透明细胞癌组织中组蛋白H3K18呈低乙酰化水平。 罗米地辛提高肾透明细胞癌细胞H3K18乙酰化水平，同时上调EN2基因的表达。EN2基因在肾透明细胞癌中低表达与其启动子区H3K18低乙酰化相关。罗米地辛能抑制肾透明细胞癌细胞的增殖，加快癌细胞的凋亡。