蛋白磷酸酶PPM1E与NF-κB/p65的相互作用及其作为肿瘤治疗新靶标的研究

我们已经发现，通过RNA干扰抑制蛋白磷酸酶PP2C家族成员PPM1E显著抑制核因子κB (NF-κB)的转录活性，并促进肿瘤细胞凋亡。但是，具体的分子机理还不清楚。运用高通量筛选，确定PPM1E小干扰RNA (siRNA)显著抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)刺激的NF-κB/p65核定位。GST-pulldown以及免疫共沉淀实验显示，PPM1E可能直接作用于NF-κB/p65。本项目拟进一步采用p65蛋白磷酸化位点突变、免疫共沉淀和高内涵筛选等，获得PPM1E直接调控p65蛋白磷酸化的可靠证据。同时，以体外培养的肿瘤细胞以及裸鼠皮下移植瘤为实验对象，阐明PPM1E siRNA促进肿瘤细胞凋亡的分子机制，为确立PPM1E作为肿瘤治疗的新靶标提供更充分的科学依据。

核因子κB (nuclear factor-kappaB, NF-κB)在细胞生长、存活、凋亡等过程中，发挥了极其重要的作用。大量研究表明，转录因子NF-κB的活化与肿瘤发生、生长和肿瘤细胞对药物的抵抗等有着密切的联系。对NF-κB转录活性的精确调控有赖于蛋白激酶和蛋白磷酸酶的协同作用。相对于蛋白激酶对NF-κB转录活性的调控方面的研究，关于蛋白磷酸酶在NF-κB信号通路中的作用的研究甚少。我们通过筛选发现，蛋白磷酸酶PP2C家族成员PPM1E对NF-κB转录活性有十分重要的调节作用。PPM1E小干扰RNA (siRNA)显著抑制肿瘤坏死因子α (TNFα) 刺激的NF-κB/p65的核定位，并促进肿瘤细胞凋亡。在此基础上，我们对p65蛋白的入核调控进行了深入研究。利用高内涵筛选系统，我们筛选得到importin β家族的3个成员KPNB1，XPO7和IPO8负责p65的入核转运。KPNB1，XPO7和IPO8能直接跟p65复合体相互作用。其中，KPNB1是最主要的p65入核受体，依赖importin ɑ家族成员KPNA2以及p65自身的核定位序列（nuclear localization signal, NLS）。而XPO7和IPO8与p65的相互作用不依赖p65的NLS。我们的结果表明，importin β家族在p65的入核调控中起着重要的作用，这在一定程度上增加了我们对p65调控机制的了解。同时，我们对PPM1E siRNA促进肿瘤细胞凋亡的分子机制进行了研究。我们发现PPM1E siRNA引起肿瘤细胞内ROS水平的升高，并激活了p53蛋白的表达以及转录激活，从而引起细胞凋亡。研究结果为确立PPM1E作为肿瘤治疗的新靶标提供了更充分的科学依据。