隐球菌通过S100A10活化尿激酶-纤溶酶系统侵袭血脑屏障的机制研究

Cryptococcus neoformans(C. n) is a medical fungus which badly damage huamn health by causing fatal meningoencephalitis,and the relationship between C.n and the blood-brain barrier(BBB) may be the key for C. n addicted to central nervous system(CNS).It's known that plasmin, urokinase activation contribute to the C.n travel across the BBB,and the plasminogen system activation requires the expression of S100A10 in tumor cells. Previously we found that C.n can upregulate the expression of S100A10 in endothelial cells, but the relationship between the increased expression of S100A10 and the ability of C.n travel across the BBB is unclear.We plan to investigate how can C.n upregulate S100A10 expression and its significance.We propose to confirm the up-regulation of S100A10 and urokinase by C.n，and construct the lentiviral vector which can silence S100A10, observing the ability of C.n travel across BBB composed of S100A10 silenced endothelial cells, and detect the activation of plasmin,urokinase and matrix metalloproteinases in the BBB system,verifing whether the silencing of S100A10 affect the ability of C.n travel across BBB by inhibiting plasmin and matrix metalloproteinases.Then we propose to observe the preventive effect of matrix metalloproteinase inhibitor on cryptococcosis, providing new ideas for clinical prevention and treatment of cryptococcosis.

隐球菌引起的中枢神经系统感染严重危害着人类的健康，其与血脑屏障的关系可能是嗜中枢性的关键所在。研究表明，活化的纤溶酶系统有助于隐球菌通过血脑屏障，且另有研究表明纤溶酶系统的活化需要S100A10的参与。我们前期研究发现隐球菌可以上调内皮细胞S100A10的表达，这是否有助于隐球菌活化纤溶酶系统并侵袭血脑屏障仍未明确。本课题拟明确隐球菌上调脑微血管内皮细胞S100A10表达的病理生理意义。我们拟通过构建慢病毒载体沉默S100A10的表达，观察其对隐球菌通过血脑屏障的能力的影响,并观察沉默S100A10是否影响纤溶酶系统及基质金属蛋白酶的活化，进而影响隐球菌通过血脑屏障的能力。并进一步观察基质金属蛋白酶抑制剂对中枢神经系统隐球菌病的预防作用，为临床防治提供新的思路。

隐球菌（Cryptococcus）系环境腐生菌，也是重要的机会致病真菌，中枢神经系统感染是隐球菌病最主要的临床表现，超过 90%的隐球菌病侵犯中枢神经系统，隐球菌性脑膜炎/脑膜脑炎（Cryptococca meningitis / meningoencephalitis，CME）是其高病死率的最主要病因。血脑屏障便是隐球菌侵袭中枢神经系统的必经关卡。S100A10蛋白是一种纤溶酶原调节蛋白，脑血管内皮细胞可以表达S100A10蛋白，其在接受刺激后可与膜联蛋白A2（annexin A2）结合为异四聚体(S100A10)2-(annexinA2)2并作为膜蛋白，继而使纤溶酶原被tPA（组织型纤溶酶原激活剂）、uPA（尿激酶型纤溶酶原激活剂）激活为纤溶酶，同时激活基质金属蛋白酶，降解细胞基质。MMP9蛋白是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶MMPs（Matrix metalloproteinase，MMP）家族中的一员，其功能在于分解除多糖以外的全部细胞外基质成分，其中MMP-9分解IV、V、VII、X、XI、弹性蛋白、微纤维蛋白、层粘连蛋白、骨连蛋白。.我们将新生隐球菌感染b.End3，研究S100A10、UPA和MMP9在mRNA水平和蛋白水平的表达情况。进而分别构建稳定下调S100A10和MMP9基因的小鼠脑微血管内皮细胞的细胞系，对比观察其是否影响纤溶酶-尿激酶系统及基质金属蛋白酶的活化，是否影响隐球菌通过血脑屏障的能力。并进一步探索基质金属蛋白酶抑制剂对中枢神经系统隐球菌病的预防作用，为临床防治提供新的思路。.在成功构建稳转细胞系和体外血脑屏障模型基础上，我们发现：第一，新生隐球菌能上调b.End3高表达S100A10、UPA和MMP9；第二，新生隐球菌能通过上调内皮细胞S100A10表达，从而激活尿激酶-纤溶酶系统，促进其通过血脑屏障的能力；第三，新生隐球菌能上调内皮细胞S100A10表达，进而影响b.End3 MMP9的表达，增强通过血脑屏障的能力。第四，稳定下调b.End3 的MMP9表达后，新生隐球菌穿越血脑屏障的能力下降，且血脑屏障的稳定性更高。第五，我们成功构建了小鼠的隐球菌感染模型，发现注射GM6001的小鼠颅内菌荷量更少。