鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC7通过宿主EGFR-Akt通路抑制细胞的凋亡及机制研究

Some EGF-like domain-containing microneme proteins (MICs) of apicomplexan parasites are EGFR ligands, which can activate the EGFR-Akt pathway, and then regulate the expression of mitochondrial apoptosis pathway related proteins to inhibit host cell apoptosis. Apicomplexan parasite Eimeria tenella can cause huge economic loss in poultry industry. Does the newly discovered E. tenella MIC7 which characterized by EGF-like domain have the same function mentioned above? In the proposed research project, by analyzing whether EGF-like domain of E. tenella MIC7 (EGF-EtMIC7) binds to EGFR and induces phosphorylation of EGFR, the possibility of EtMIC7 as a ligand for chicken EGFR will be determined. By analyzing the effects of EGF-EtMIC7 on apoptosis of cells treated with apoptosis inducer, anti-apoptosis effects of EtMIC7 will be determined. By analyzing the activation of EGFR-Akt pathway in response to EGF-EtMIC7, the anti-apoptosis effects of EGF-EtMIC7 after blocking this pathway, and the effects of EGF-EtMIC7 on the molecules related to the mitochondrial apoptosis pathway, the mechanism of anti-apoptosis effects of EtMIC7 will be elucidated. The expected results will lay a foundation for elucidating the intracellular survival mechanism of chicken coccidia through regulating host cell apoptosis, and also will provide theoretical basis for developing effective strategies against chicken coccidia.

顶复门原虫某些含EGF样结构域的微线蛋白（MICs）能作为宿主EGFR的配体，激活EGFR-Akt通路并调控线粒体凋亡途径相关蛋白的表达，以抑制细胞的凋亡。柔嫩艾美耳球虫是严重危害养鸡业的顶复门原虫，其新近发现的含EGF样结构域的MIC7是否也具有上述功能？本项目拟通过分析柔嫩艾美耳球虫MIC7的EGF样结构域（EGF-EtMIC7）对鸡EGFR的结合和磷酸化，明确EtMIC7是否为鸡EGFR的配体；通过分析EGF-EtMIC7刺激对凋亡诱导剂处理的细胞凋亡的影响，明确EtMIC7是否有抗凋亡作用；通过分析EGF-EtMIC7对EGFR-Akt通路的激活、阻断该通路对EGF-EtMIC7抗凋亡的影响及EGF-EtMIC7对线粒体凋亡途径相关分子的影响，阐明EtMIC7抗凋亡的机制。预期结果可为阐明鸡球虫调控宿主细胞凋亡的胞内生存机制奠定基础，同时为寻求有效的鸡球虫病防控策略提供理论依据。

鸡球虫病是由一种或多种艾美耳属的球虫引起的肠道寄生虫病。其中，柔嫩艾美耳球虫是致病力最强虫种之一，对全世界禽类养殖业危害巨大。入侵宿主细胞是柔嫩艾美耳球虫完成其生活史的重要一环，微线蛋白被报道在该过程中发挥重要作用。另外，其他顶复门原虫的某些含EGF样结构域的微线蛋白能够激活表皮生长因子受体。该通路参与细胞的增殖、分化和凋亡的调节。柔嫩艾美耳球虫编码多种含EGF样结构域的微线蛋白，但是目前关于其功能的研究较少，其中就包括含4个EGF样结构域的微线蛋白7。.为探明微线蛋白7的生物学功能，本项目主要进行了以下几方面的研究：一、重组表达微线蛋白7的EGF样结构域并制备多克隆抗体，以其作为一抗，阐明了微线蛋白7在虫体的子孢子和裂殖子阶段均表达，为后续功能研究奠定了基础。二、在AG1478存在与否的情况下，通过分析孵育重组表达的微线蛋白7的EGF样结构域后的LMH细胞的Akt磷酸化，证实了微线蛋白7的EGF样结构域可激活EGFR-Akt信号通路。三、通过与饥饿处理的LMH细胞孵育，证实了微线蛋白7的EGF样结构域可促进细胞增殖；重组表达的微线蛋白7的EGF样结构域上调Bcl-2蛋白表达初步证实了微线蛋白7参与宿主细胞凋亡的调控。四、在完成研究任务的基础上，我们利用过表达结合转录组测序，研究了3个柔嫩艾美耳球虫基因的功能。结果显示，棒状体蛋白17参与先天免疫、虫体胞内增殖和对抗微生物感染等过程；致密颗粒蛋白12参与宿主代谢，免疫和微生物的调节；ETH_00028350编码的蛋白参与免疫和炎症反应。另外，我们原核表达了棒状体蛋白17，并对其免疫保护效力进行了评估。结果显示，棒状体蛋白17是潜在的疫苗候选分子。以上结果丰富了柔嫩艾美耳球虫和宿主的分子互作机制，助力于开发新的鸡球虫病防控策略。