SDF-1/CXCR4生物轴通过Wnt-β-catenin信号通路使肝卵圆细胞激活和增殖的机制

It is known that the SDF/CXCR4 promotes the activation of quiescent hapatic stems cells into oval cells and stimulates oval cell proliferation. In our previous study, a CXCR4 antagonist, AMD3100 or stable RNAi, of CXCR4 was used to knock down CXCR4 expression in the well-characterized 2AAF/PHx rat model to determine the role of CXCR4 in oval cell activation and differentiation, which indicates that SDF-1/CXCR4 is an essential molecule required for proliferation and/or promote the oval cell activation during liver regeneration. In our recent study, in the same well-characterized 2AAF/PHx rat model, β-catenin,GSK-3β and Wnt-1 mRNA hepatic expression varied In parallel with the number of oval cells, therefore, do the SDF-1/CXCR4 axis mediate the activation and proliferation of oval cell by Wnt-β-catenin signaling pathway? The aim of this study is to determine the mechanism of the SDF-1/CXCR4 axis which mediate the activation and proliferation of oval cell by Wnt-β-catenin signaling pathway in cell culture, transmission Electron Microscopic Examination, immunohistochemistry, siRNA,RT-PCR, and Western Blots methlods, a better understanding of its role in hepatic stem cell proliferation and differantation can lead to the successful manipulation of liver biology for therapeutic purposes.

业已证实, SDF-1/CXCR4生物轴参与了肝卵圆细胞的激活和增殖过程。申请者首次报道采用最强的拮抗剂AMD3100封闭CXCR4，以使配体SDF-1失活，同时用干扰RNA敲除CXCR4基因的方法证明了肝卵圆细胞激活和增殖的确与SDF-1/CXCR4生物轴有关。最近,我们发现，同样是AAF∕PH组大鼠模型，术后β-catenin,GSK-3β,Wnt-1蛋白表达量变化与卵圆细胞数量明确相关,那么,SDF-1/CXCR4生物轴是不是通过Wnt-β-catenin信号通路使肝卵圆细胞激活和增殖?针对上述问题,本项目拟主要采用细胞培养、电镜观察、免疫荧光染色、siRNA干扰、RT-PCR、Western Blots等方法,旨在揭示一种调控肝卵圆细胞激活和增殖的新机制,以助于通过调节SDF-1-CXCR4生物学轴作用，促进卵圆细胞的增殖以解决移植细胞来源不足问题。

目的：探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂在肝卵圆细胞增殖和迁移中的作用及其机制。.方法：1. 应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（SAHA和TSA），mTOR抑制剂雷帕霉素, AKT抑制剂LY294002或mTOR激动剂C8-PA单独或联合处理WB-F344肝卵圆细胞。2. 倒置显微镜观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂和mTOR抑制剂对卵圆细胞形态及数量的影响。3. MTT方法检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂，mTOR抑制剂，AKT抑制剂或mTOR激动剂单独或联合应用对肝卵圆细胞增殖活性的影响；4. 流式细胞术检测肝卵圆细胞的干细胞标志物OV-6的表达情况，SAHA和TSA对肝卵圆细胞的细胞周期和凋亡的影响。5. Western blot技术检测肝卵圆细胞中凋亡调控蛋白的表达，包括促凋亡因子caspase3，Bim，PUMA，Bax蛋白的水平和抗凋亡调控因子Bcl-2蛋白水平，AKT/mTOR信号通路及下游相关蛋白和磷酸化蛋白的表达，组蛋白H3和乙酰化组蛋白H3的表达，细胞增殖相关蛋白的表达，包括PCNA, CyclinD1, c-Myc和Bmi1。6. 划痕试验观察SAHA和TSA对肝卵圆细胞迁移能力的影响；.结果：1. 肝卵圆细胞系WB-F344细胞在培养过程中干细胞性能未发生改变。2. 组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACIs）抑制肝卵圆细胞增殖活性呈剂量和时间依赖性。3. HDACIs通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进促凋亡蛋白caspase3，Bim，PUMA和Bax的蛋白表达来诱导肝卵圆细胞凋亡，使其停留在细胞周期的G0/G1和S阶段。4. HDACIs剂量-时间依赖性抑制了细胞增殖相关蛋白PCNA，CyclinD1，c-Myc 和Bmi1的蛋白表达，促进了乙酰化组蛋白H3的表达。5. HDACIs抑制了卵圆细胞迁移能力。6. HDACIs剂量依赖性地抑制了AKT/mTOR及其信号通路下游分子p70S6K, 4E-BP1 和S6的活性，即降低了其磷酸化水平。7. mTOR和AKT的活性影响卵圆细胞的增殖和凋亡。8. mTOR抑制剂雷帕霉素可增强HDACIs对卵圆细胞的增殖抑制作用，而mTOR激活剂C8-PA部分地逆转了HDACIs对卵圆细胞的抑制作用。.结论：组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过抑制AKT/mTOR信号通路抑制卵圆细胞增殖和迁移，可能为临床肝癌的治疗提供新的思路和理论依据。