糖尿病肾病小鼠体液和肾组织中的代谢调控通路与关键蛋白研究

Diabetic nephropathy (DN), a leading cause of end-stage renal disease, poses a global threat for its high morbidity and mortality. So far, the pathogenesis and biomarkers of DN remain unclear. Therefore, it is urgent to establish a novel and systematical protocol to explore new therapeutic targets for DN. In the present project, we utilize 1H nuclear magnetic resonance (1H NMR)-based metabonomics to study the metabolic changes during onset and development of DN in db/db mice from 6 to 17 weeks. Based on public database resources, metabolic regulatory networks will be constructed to identify specific biomarkers of DN. In addition, we attempt to screen key proteins or enzymes that result in metabolic disturbance by using molecular biology technologies including Western blot and RT-PCR. The results proposed in the present project will ultimately provide not only potential targets for drug discovery, but also invaluable information for early clinical diagnosis and process monitoring of DN. Moreover, the protocol established in our study offers a new method to understand pathological mechanism and identify therapeutic targets of DN.

糖尿病肾病(DN)发病率高、危害严重，是引发终末期肾功能衰竭的主要原因。目前对DN的生物标志物和发病机制还不清楚，迫切需要新的研究思路进行系统性研究，同时寻找药物治疗的新靶点。本项目拟应用基于核磁共振的代谢组学技术研究糖尿病肾病模型db/db小鼠从肾病发生前到肾病发生、发展中(6周龄—17周龄)的代谢调控通路变化，寻找并确认与DN发生发展相关的生物标志物，结合代谢物数据库筛选导致代谢通路紊乱的关键调控蛋白或酶，借助Western blot免疫印迹和RT-PCR等分子生物学技术进行功能考察和验证，为治疗DN的药物研发提供潜在的靶点，也为DN临床早期诊断和进程监测提供理论依据。同时本项目从系统到还原、从整体到局部、从宏观到微观的研究思路也有望为疾病的分子机制阐述和药物新靶点的探索提供新的方法补充。

糖尿病肾病作为一种高发性糖尿病并发症，对人类健康产生的危害极大，然而目前的治疗策略却很有限。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）被报道在慢性肾脏的功能和形态损害治疗中起着重要的作用，然而bFGF在糖尿病肾病中的代谢机制尚不清楚。在本研究中，我们发现db/db小鼠被给予10周的bFGF后，它的血糖显著降低并且提高了血清中胰岛素的敏感性。进一步我们检测了小鼠的肾功能相关指标，结果显示bFGF干预治疗后，db/db小鼠尿液中的尿白蛋白肌酐比(UACR)、尿素氮(UN)和尿酸(UA)的异常代谢得到了显著的改善。此外，肾脏病理结果显示bFGF还可以改善db/db小鼠肾脏中系膜扩张，肾小管损伤和纤维化。分子生物学实验结果显示bFGF可以抑制肾脏中TGF-β1和Type IV collagen的表达。这些结果表明bFGF可以抑制糖尿病肾病纤维化的发生。总之，我们的结果表明bFGF对糖尿病肾病可能具有潜在的治疗作用。. 接下来我们运用核磁共振代谢组学技术检测了小鼠尿液及肾脏组织的代谢变化。结果表明，bFGF可以重塑db/db小鼠肾脏和尿液的代谢表型，主要涉及能量代谢、甲胺代谢、渗透调节和氧化应激等。有趣的是，在肾脏的代谢模式分析中我们发现牛磺酸的贡献最大。定量结果显示，bFGF治疗可以逆转db/db小鼠牛磺酸含量的降低，而牛磺酸作为抗氧化物质可以保护组织器官免受氧化应激的损害。因此我们猜测bFGF可以通过抑制氧化应激从而保护肾脏。我们发现bFGF治疗可以逆转db/db小鼠肾脏中MDA含量的升高和SOD含量的降低。同时PCR结果显示，bFGF干预治疗后氧化应激相关物质Nox4、Nox2、Nrf2、Sod2、Nqo1的表达发生逆转。这些结果表明bFGF可以抑制肾脏组织中氧化应激的发生。此外，我们进一步的研究发现，bFGF干预治疗后，凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3/Caspase-3和Bax/Bcl-2的比值显著降低，表明bFGF还可以抑制肾脏组织的凋亡。综上所述，我们的研究结果揭示了bFGF可以改善糖尿病肾病引起的代谢紊乱，此外bFGF抑制肾脏的氧化应激和凋亡可能是通过NOX-ROS-Nrf2信号通路介导的。