缺氧微环境活化RANKL/RANK通路靶向NK细胞介导乳腺癌干细胞免疫逃逸机制研究

Growing evidence suggests that cancer stem cells (CSCs) are regarded as a necessary and important cellular target in cancer therapeutic maneuver.It has been demonstrated that NK cells play a critical role in anti-tumor immunity, and CSCs are more susceptible to NK cells mediated cytotoxicity. Hypoxia in the tumor microenvironment can inhibit antitumor immune responses and thus enhance tumor immune escape,but the precise mechanism is not well understood.Recent findings suggested that therapeutic targeting of RANKL may serve to reinforce NK cells functions in leukemia patients. We have previously found:1.Breast cancer stem cells(BCSCs) overexpress RANKL; 2. Hypoxia can upregulate RANKL expression in breast cancer cells mediated by hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1alpha);3. Recombinant human RANKL can inhibit IFN-γ production in NK-92 cell. Accordingly, in our present study, we hypothesized that hypoxia could regulate RANKL expression by HIF-1a in BCSCs，RANKL interacts RANK on the surface of NK cells, and then induce the signal transducer and activator of transcription 3( STAT3) phosphorylation. The activation of STAT3 decrease the IFN-γ,Granzyme B,perforin,DNAM-1 and NKG2D expression in NK cells. The effect inhibits antitumor immune responses of NK cells. These findings may contribute to deepen the understanding of immunosurveillance of BCSCs and lead to the development of more effective therapies.

肿瘤干细胞是肿瘤治疗的突破点。研究表明NK细胞能够特异性作用于肿瘤干细胞，但以缺氧为主要特征的肿瘤微环境可导致肿瘤干细胞发生免疫逃避，具体机制有待阐明。近期研究发现，RANKL/RANK介导了白血病细胞对NK细胞的免疫耐受。我们的前期的工作证实：1.乳腺癌干细胞高表达RANKL;2.缺氧能够通过HIF-1α增加乳腺癌细胞RANKL的表达；3.重组人RANKL能够抑制NK细胞株NK-92细胞IFN-γ分泌。基于上述报道及研究基础，我们推测缺氧微环境下，乳腺癌干细胞通过HIF-1α调控促进RANKL表达，并与NK细胞RANK受体结合，通过STAT3的磷酸化，抑制识别受体NKG2D以及IFN-γ、颗粒酶B，穿孔素等细胞毒性效应分子表达，最终抑制NK细胞的生物活性，使得乳腺癌干细胞逃逸NK细胞的免疫效应。本研究有望对了解乳腺癌干细胞免疫耐受机制、寻找针对乳腺癌干细胞的免疫治疗靶点提供依据。

乳腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤，也是女性肿瘤相关死亡的主要原因。肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)由多种包括免疫细胞在内的多种细胞类型和细胞外成分组成，包围肿瘤细胞，并通过血管网为其提供营养。以往的研究表明，TME在肿瘤的发生和发展过程中起着关键作用，并影响治疗结果。核因子κ B配体(Receptor activator of the nuclear factor kappa B ligand, RANKL)受体激活因子(Receptor activator of the nuclear factor kappa B ligand, RANKL)已被确定为TME的一个感兴趣的靶点，特别是在促进免疫抑制环境和随后的免疫治疗耐药性方面。我们使用在线生物信息学工具，根据免疫指数确定3个不同的乳腺癌亚型，并验证其预后价值。此外，我们还发现了8个与乳腺癌免疫微环境密切相关的新的预后分子生物标志物。我们在一项队列研究中验证了8个基因在乳腺癌组织中的表达。同时在本研究中，我们发现RANK在化疗耐药乳腺癌细胞中的表达显著增加。我们还发现RANKL能有效增强乳腺癌细胞的化疗耐药潜能。我们的结果显示RANKL可以诱导乳腺癌细胞自噬，并增强自噬相关基因的表达。STAT3信号通路参与RANKL诱导的乳腺癌细胞自噬。本研究我们还观察了lncRNA CDKN2B-AS1在人乳腺癌中的生物学作用和功能。结果显示，与相应的癌旁正常组织相比，CDKN2B-AS1在乳腺癌组织中表达相对丰富。与人乳腺上皮细胞相比，CDKN2B-AS1在乳腺癌细胞中也有大量表达。然后，干扰 CDKN2B-AS1可以抑制MCF7和T47D细胞的恶性生物学行为。在机制上，CDKN2B-AS1抑制 miR-122-5p调控STK39的表达。体内实验表明：干扰 CDKN2B-AS1可以抑制乳腺癌的生长。证实了CDKN2B-AS1的下调通过miR-122-5p/STK39通路抑制乳腺癌的进展。最后我们观察了过表达GSDME的乳腺癌MDA-MB-231细胞在阿霉素作用后的焦亡情况。我们发现阿霉素促进过表达GSDME MDA-MB-231细胞的焦亡。通过本课题的研究，我们得到了3种乳腺癌免疫亚型，并利用免疫指标进行了鉴定，有助于对乳腺癌肿瘤免疫微环境的认识，我们同时发现了RANKL可能通过诱导自噬而导