YdiU通过单磷酸腺苷酸化修饰调控鼠伤寒沙门菌抗氧化酶的分子机制研究

The antioxidant enzyme system plays an important role in protecting Salmonella from oxidative damage, but the regulation of antioxidant enzymes by post-translational modification has not be well-studied. Previously, our group demonstrated that YdiU played an important role in the regulation of antioxidation and pathogenicity in Salmonella. We further confirmed that YdiU catalyzed the AMPylation modification of three antioxidant enzymes (SodA, SodB, AhpC). Therefore, we speculated that YdiU might modulate the pathogenicity of Salmonella by regulating the antioxidant ability through AMPylationof antioxidant enzymes. This project intends to prove this hypothesis and explain the underlying molecular mechanism. Firstly, the AMPylation sites of SodA, SodB and AhpC will be identified. Then the purification methods of AMPylated protein will be explored. Furthermore, the effect of AMPylation on antioxidant will be further revealed by crystal structures of AMP-enzymes. With the help of necessary infection experiments, the role of YdiU-mediated AMPylation of antioxidant enzymes in the Salmonella pathogenic processwas systematically studied. This research will be a supplement to the regulation mechanism of antioxidant enzyme and YdiU function, and provide theoretical basis for the study of survival and pathogenesis of Salmonella typhimurium.

抗氧化酶体系在保护沙门菌免受氧化损伤方面起着重要作用，然翻译后修饰调控抗氧化酶的报道甚少。本课题组前期鉴定到一种催化蛋白单磷酸腺苷酸化（AMPylation，AMP化）修饰的酶YdiU在沙门菌抗氧化及致病性调控过程中发挥重要作用，并进一步证实YdiU能够催化SodA、SodB、AhpC等抗氧化酶发生AMP化修饰。因此推测YdiU是通过介导抗氧化酶的AMP化修饰调控沙门菌抗氧化能力进而影响沙门菌致病性的。本项目拟证明此假说并阐释这一过程的分子机理及意义。在鉴定抗氧化酶AMP化修饰位点的基础上，摸索AMP化修饰后蛋白的纯化方法，通过对提纯的AMP化修饰的抗氧化酶进行活性测定和晶体结构解析，结合必要的感染实验，系统地研究YdiU介导的抗氧化酶AMP化修饰在沙门菌致病过程中的作用。本研究是对抗氧化酶活性调控机制及YdiU功能研究的重要补充，并为鼠伤寒沙门菌生存和致病机制的研究提供重要的理论基础。

鼠伤寒沙门菌是一种重要的人畜共患的肠道致病菌。关于鼠伤寒沙门菌生存和致病机制的研究在医学和公共卫生领域都具有重要的价值。鼠伤寒沙门菌可以在巨噬细胞内的沙门菌囊泡中存活，但是宿主的氧化杀伤作用是沙门菌在入侵后所面临的一个巨大挑战，巨噬细胞产生活性氧（ROS）可以对囊泡里的沙门菌造成一系列的杀伤。沙门菌是如何应对宿主的氧化杀伤作用是本课题要研究的内容。.前期我们课题组发现ydiU基因在沙门菌致病过程发挥重要作用。并且发现YdiU是一个新型的UMP化修饰酶，可以广泛的修饰底物来调控其功能。同时，在用H2O2模拟氧化应激环境时，发现YdiU的表达升高。.动物实验表明△ydiU具有超强的致病能力，而对于ROS 缺陷型小鼠接种WT和△ydiU存活率几乎没有差别。生长曲线和生存率实验，证明H2O2压力下，△ydiU沙门菌抗氧化能力更强。由此我们推测鼠伤寒沙门菌△ydiU的超强致病能力可能是通过抗氧化能力增强实现的。.通过质谱鉴定到和抗氧化功能相关的UMP化蛋白主要是SodA。SodA是MnSOD，它可以催化超氧阴离子转化为H2O2，继而在过氧化氢酶等的作用下转化为无毒性的水。SodA变性前后结构发生了变化。YdiU可以和变性后的SodA相互作用，变性后的SodA易被UMP化修饰且修饰位点为Y12。SodA酶活性测定实验初步显示了YdiU修饰后，SodA的酶活性是下降。因此我们提出了假说: 鼠伤寒沙门菌YdiU通过UMP化修饰氧化损伤后的SodA影响细菌的氧化还原稳态，即当细菌遭遇过量H2O2时，体内H2O2的增加引起SodA蛋白的变性，同时H2O2启动了YdiU表达，变性后的SodA容易被UMP化修饰，影响SodA酶活性，进而影响细菌抗氧化能力。本研究是对抗氧化酶活性调控机制及YdiU功能研究的重要补充，并为鼠伤寒沙门菌生存和致病机制的研究提供重要的理论基础。