活体荧光成像实时监测病毒特异性细胞毒性T细胞对HCV复制的抑制作用

丙型肝炎病毒（HCV）是一种严重危害人类健康的病原体，目前还没有有效的疫苗和药物。由于缺乏合适的HCV复制和感染小动物模型，严重阻碍了宿主T细胞与HCV相互作用研究以及免疫效应细胞体内抗病毒效果评价。对此本项目拟构建报告基因萤火虫荧光素酶（Fluc）标记的HCV复制子，将此复制子转染稳定表达人HLA-A2的Huh7细胞，建立HCV复制细胞体系。然后将此细胞移植到免疫缺陷小鼠体内建立HCV复制细胞体内移植小鼠模型。体外分离、培养扩增HCV患者和健康个体CD8+T细胞，负载病毒特异性CTL表位后，进行Gaussia荧光素酶标记。将此标记的病毒特异性T细胞输注入移植了HCV复制细胞的模型小鼠体内。通过活体内双荧光成像技术实时监测特异性T细胞在体内的分布、迁移，以及在体内对HCV复制的抑制作用。本研究将为宿主T细胞与HCV体内相互作用的研究，以及为免疫效应细胞体内抗病毒作用效果的评价提供基础平台。

本研究首先建立了Fluc报告基因标记的HCV基因组和亚基因组复制子细胞模型，并用该细胞模型对Sorafenib和IFN的抗HCV效果进行了评价。在HCV复制细胞模型的基础上，建立了Fluc报告基因标记的、且稳定表达HCV 1406-1415 T细胞表位和HLA-A2的HCV复制子细胞模型，该细胞移植到小鼠体内后可通过活体成像实时监测HCV特异性T细胞在体内的功能。用IFN信号通路特异性的shRNA对复制子细胞进行处理，然后将Fluc报告基因标记的HCV复制子细胞移植到SCID/Beige免疫缺陷小鼠体内，移植后通过活体成像技术监测小鼠体内荧光素酶活性，发现shSTAT2能提高并延长HCV在体内的表达水平，移植后HCV在体内的表达水平能接近一个月。说明建立了Fluc报告基因标记的HCV复制子细胞的SCID/Beige移植小鼠模型，可用于对HCV特异性T细胞在体内的功能进行评价。.然后建立了慢病毒包装体系，构建了萤火虫荧光素酶（Fluc）或膜锚定Gluc报告基因标记的、可用于进行体内活体成像实时监测T细胞分布、定位、归巢和激活的多种慢病毒载体。.最后优化了T细胞培养条件，可在体外大量扩增T细胞，为进行T细胞慢病毒转导提供了足够的细胞。并构建了表达HCV特异性的T细胞表位受体（TCR）的慢病毒载体，用包装的携带HCV特异性的TCR基因的慢病毒感染体外扩增的原代T细胞，能识别HCV复制子细胞上HLA-A2提呈的HCV T细胞表位1406-1415 T细胞表位，将转导TCR的T细胞和HCV复制子靶细胞在体外共培养，证明经TCR转导的HCV特异性T细胞对复制子细胞内的HCV复制具有非常明显的抑制作用。将共表达HCV T细胞表位、HLA-A2、Fluc报告基因标记的HCV复制子细胞的移植到SCID/Beige移植小鼠体内，在体内输入HCV特异性的TCR基因的体外扩增的原代T细胞，用活体成像对HCV特异性T细胞在体内的功能进行评价，发现HCV复制没有受到明显抑制。原因可能是由于慢病毒系统对原代T细胞的转导效率太低，仅4%左右。目前正在对慢病毒转导原代T细胞的条件进行优化，以期对原代T细胞实现高效转导，能够应用活体成像技术对HCV特异性CTL在体内的功能进行研究，并对其分布、归巢和活化进行示踪成像。