ATG4C调控GABARAP介导的自噬体-溶酶体融合影响替莫唑胺敏感性及机制研究

Autophagy plays an important role in temozolomide (TMZ) chemotherapy resistance on glioma, but the underlying mechanism remains unclear yet. Data mining showed that ATG4C was an independent risk factor for the prognosis of glioma patients. Our results showed that ATG4C knockdown inhibited glioma growth,suppressed autophagy flow, then promoted ROS production and the expression of autophagy proteins LCII and P62.Additionally, ATG4C ablation significantly inhibited TMZ-activated autophagy and increased TMZ chemosensitivity.The String database indicated that ATG4C might interact with GABARAP family proteins, which could regulate mitophagy by binding Nix on the mitochondrial membrane to produce ROS.And ROS may change lysosomal pH value, which regulates the late autophagosome-lysosome fusion and mediate the TMZ sensitivity. This project aims to systematically investigate the effects of ATG4C on autophagosome-lysosome fusion and TMZ chemosensitivity and underlying mechanism by using flow cytometry technology, fluorescence live-cell imaging, electron microscopy, immunoprecipitation assay and so on. .

自噬对脑胶质瘤发生发展及替莫唑胺（TMZ）敏感性起着重要调控作用，但机制尚不明确。利用数据挖掘发现ATG4C基因是胶质瘤患者预后的独立危险因素；动物及细胞实验表明干扰ATG4C表达可抑制裸鼠体内成瘤，促进凋亡，抑制自噬流，增加ROS释放量及自噬蛋白LCII 、P62表达，加入TMZ自噬及胶质瘤细胞活力均受到抑制。进一步的生物信息挖掘和文献查阅提示ATG4C可能通过影响GABARAP家族蛋白的功能，以及通过GABARAP/Nix介导的线粒体自噬，经ROS介导的溶酶体pH值改变而间接抑制自噬体-溶酶体融合，调控机制促进TMZ的敏感性介导TMZ敏感性。本项目拟在临床、动物及分子机制上联合运用流式技术，活细胞荧光显微检测技术，电镜观察自噬体及自噬溶酶体，免疫共沉淀等方法系统研究ATG4C调控自噬体和溶酶体融合影响TMZ敏感性分子机制。

ATG4CmRNA表达是低级别胶质瘤患者OS与RFS独立因素，且胶质母细胞瘤组织中ATG4CmRNA表达水平显著高于正常脑组织，GSVA分析ATG4C与自噬、脂代谢和能量平衡等生物过程能密切相关，敲减胶质瘤原代细胞ATG4C基因，抑制细胞增殖；BALB/C裸鼠皮下成瘤实验表明敲减ATG4C肿瘤生长显著减缓，且肿瘤组织中ATG4C、Ki67和LC3蛋白表达降低；敲减ATG4C细胞周期阻滞，细胞凋亡率、活性氧和Caspase-3/6/9活性增加，同时 P21、P53、LC3-Ⅱ、P62蛋白表达水平表达上调， Cyclin E表达下调；敲减ATG4C自噬流抑制且可能影响自噬小体、自噬小体和自噬溶酶体的融合，电镜结果表明细胞中自噬小体样囊泡数量下降；同时建立ATG4CKO细胞株，敲除ATG4C衰老、细胞程序性死亡、G2细胞阻滞等信号通路富集增加，而NABACOREMATRISOME、细胞外基质蛋白聚糖等生物过程富集减少； TMZ促进自噬的发生，RT-qPCR检测TMZ处理后胶质瘤细胞中ATG4CmRNA表达增加，Baf-A1干预下，干扰ATG4C表达可以逆转TMZ引起的LC3-Ⅱ表达水平增加及转染GFP-LC3质粒的胶质瘤细胞中绿色荧光信号增加；同时显著降低替莫唑胺IC50。实验结果解析ATG4C在自噬和胶质瘤发生中的作用及增加替莫唑胺敏感性的影响和机制，将促进特异性更高的胶质瘤治疗药物的研发。