噬菌体SWU1杀菌过程中ROS的作用及产生机制研究

Our recent study indicated that ROS levels were enhanced in Mycobacterium smegmatis mc2155 treated with phage SWU1. However, the role and production mechanism of ROS in phage infection processes is indistinct. To this end, we focus on SWU1-induced ROS. To determine if ROS contribute to SWU1 induced killing of host cells, we will investigate phage lethality under conditions in which ROS accumulation is limited. To determine the function of SWU1-induced ROS formation, we will quantify protein carbonylation levels, 8-oxo-dG levels and 8-oxo-G levels when M. smegmatis are infected by SWU1. To determine the mechanism of SWU1-induced ROS formation, we will detect expression of some genes in glycolytic pathway by qPCR and the NAD+/NADH ratio when M. smegmatis are infected by SWU1. Furthermore, NADH oxidase gene mutant and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene mutant will be constructed. We will measure bacterial survival rate and level of intracellular ROS and H2O2 when mutant and wild type strain are infected by SWU1. The study will help us understand the molecular mechanism of mycobacteriophage SWU1 infection and provide theoretical basis of phage-inspired antibiotics.

申请人前期研究发现噬菌体SWU1可诱导宿主菌产生ROS，但目前国内外研究并不清楚噬菌体杀菌过程中ROS的作用及产生机制。为解决以上科学问题，我们将利用SWU1分别侵染ROS清除剂预处理及过氧化物酶过表达的宿主菌，测量细菌存活率及噬菌体一步生长曲线，证明ROS参与噬菌体杀菌过程；利用ELISA检测被SWU1侵染宿主菌中蛋白质和核酸的氧化损伤标记物，明确SWU1诱导的ROS可导致氧化损伤；利用qRCR检测被SWU1侵染宿主菌中糖酵解途径基因的转录水平，通过比色法检测胞内NAD+/NADH，证明SWU1激活细菌糖酵解途径，富集NADH；构建NADH氧化酶缺失株及3-磷酸甘油醛脱氢酶缺失株，利用荧光探针检测SWU1侵染缺失菌中过氧化氢和ROS浓度，测量细菌存活率，明确糖酵解产生的NADH在SWU1诱导ROS产生中的作用，最终阐明ROS被噬菌体诱导产生的机制。有助于指导基于噬菌体的新型抗菌药研发。

噬菌体作为细菌的病毒、天然的抗菌剂，对其杀菌机制的研究将极大地促进新型抗菌药物的研发。除噬菌体的经典杀菌途径之外，噬菌体也可以诱导宿主菌产生活性氧簇（ROS）进而促进宿主死亡，但目前国内外研究并不清楚噬菌体杀菌过程中ROS的作用及产生机制。本项目组试图揭示噬菌体诱导宿主菌产生ROS的机制。然而，在进一步实验过程中，我们发现噬菌体SWU1及其宿主耻垢分枝杆菌并不是一个理想的直接研究噬菌体诱导ROS机制及杀菌作用的模型。因此，本项目研究工作转向通过RNA-seq技术解析噬菌体SWU1在侵染宿主菌过程中，诱导菌体产生ROS的机制。我们检测了未感染、SWU1感染早期、中期和晚期的耻垢分枝杆菌的转录组。转录组比较分析发现与未感染的耻垢分枝杆菌相比，被噬菌体SWU1感染早期的细菌内有1174个差异表达基因；被噬菌体SWU1感染中期的细菌内有1821个差异表达基因；被噬菌体SWU1感染晚期的细菌内有1662个差异表达基因。进一步分析数据发现在SWU1感染的早、中、晚期都诱导了大量与ROS防御相关基因的表达量上调，说明SWU1的感染过程诱导宿主菌产生了ROS。分析代谢途径相关基因发现，糖酵解代谢被激活。推测SWU1正是通过激活糖酵解途径，大量积累NADH，进而过度氧化产生ROS。项目组试图寻找更有效的用于研究噬菌体诱导宿主菌产生ROS机制及杀菌作用的模型。在这一指导思想下，分离鉴定了一株全新的分枝杆菌噬菌体Shandong1，两株全新的大肠杆菌噬菌体SRT7和SRT8，一株新的铜绿假单胞菌噬菌体SRT6，并对它们进行了全基因组测序及基因组和比较基因组学分析。将噬菌体Shandong1划归为分枝杆菌噬菌体Cluster K类，将SRT7划归为T7-like噬菌体，将SRT8划归为T1-like噬菌体的Tunalikevirus属。其中两株大肠杆菌噬菌体具有更强的杀菌能力，有潜力作为研究噬菌体诱导下细菌中ROS产生及杀菌机制的模型，更深入的研究还在继续进行。相应研究结果揭示了噬菌体SWU1感染宿主时产生ROS的机理，丰富了对噬菌体杀菌能力的理解，有助于指导以噬菌体为基础的新型抗菌药研发；不同噬菌体的分离为相应感染性疾病的噬菌体治疗提供了依据。