间充质微泡靶向修复内皮阻断其“损伤多米诺效应”治疗难治性aGVHD的实验研究

Endothelial cells as the core of the " injury domino effect" is a key mechanism of refractory aGVHD, the current lack of effective intervention means, mesenchymal stem cells (MSC) treatment is effective but limited application. Comprehensive literature and our previous study found that MSC secretion of microbubbles (MV) of the role of the characteristics and the function of the contents are strong point to the regulation of endothelial cell function. Therefore, we speculate that exogenous infusion of MSC-MV can repair damaged endothelial cells to control refractory aGVHD. This study was to investigate the effect of MSC-MV on endothelial cell function and its improvement to endothelium fragility in vitro and in vivo. The mechanism of MSC-MV targeting and binding of exogenous miRNAs was elucidated. The MSC-MV treatment of animal refractory aGVHD efficacy, safety and other key issues need to be clear. In this study, we first clarify the mechanism of MSC treatment of aGVHD from the perspective of MV-targeted delivery of exogenous miRNAs. Based on MSC-MV and endothelial function, we can establish objective indexes to evaluate the efficacy of MSC in the body. More importantly, MSC-MV is expected to develop a new and efficient means of treating and preventing refractory aGVHD.

以内皮细胞为核心的“损伤多米诺效应”是难治性aGVHD的关键机制，目前缺乏有效干预手段，间充质干细胞(MSC)治疗部分有效但应用受限。综合文献报道及我们的前期研究发现，MSC所分泌微泡(MV)的作用特点以及其内容物功能均强烈指向内皮细胞功能调节。因此我们推测：外源性输注MSC-MV能够修复损伤内皮细胞调控难治性aGVHD。本课题拟体内外探讨MSC-MV对内皮细胞功能的影响及其对内皮脆弱性的改善；并从MSC-MV靶向性结合、高效投递外源性miRNA等角度初步阐明其机制；在此基础上，明确MSC-MV治疗动物难治性aGVHD的疗效、安全性等关键问题。本课题的完成，首先从MV靶向性投递外源性miRNA角度进一步阐明MSC治疗aGVHD的机制，基于MSC-MV和内皮功能状态能够建立评判体内MSC疗效的客观指标；更为重要的是，MSC-MV可望发展为治疗和预防难治性aGVHD的一种新型高效手段。

异基因造血干细胞移植、嵌合抗原受体T细胞治疗等免疫治疗策略是克服血液肿瘤的重要手段。但目前大部分研究均聚焦在同种异体/改造的T淋巴细胞对肿瘤的杀伤作用以及并发症方面；这些攻击因素与患者机体本身固有特性的相关性研究较少，但极具有重要性。申请人发现内皮细胞是多种组织器官的第一屏障，也是决定免疫治疗并发症严重程度的关键因素，本课题拟研究T细胞对内皮细胞的活化效应。项目执行过程中，但由于内皮细胞功能活性存在非线性调控，结合申请人方向，因此调整了部分内容。通过本项目的资助，课题组首先基于新型CD26、CD99与CD44v6等肿瘤表面标志分别构建了新型CAR-T产品，体内外验证了其对靶细胞杀伤活性。采用多种CAR-T与内皮细胞功能培养，发现CAR-T对内皮细胞存在轻度激活效应，但活化与刺激无线性相关。为了探索易自杀靶点与CD19 CAR-T构建过程中T细胞载体区别，我们采用同一个健康供者淋巴细胞，分别转染构建了CD19、CD44v6和CD26 CAR-T，单细胞测序横向对比上述三种CAR-T细胞。测序结果提示，不同类型CAR-T构建过程中其T细胞载体并无显著性差异，但易自杀的CAR-T细胞具有明显耗竭表型，推测耗竭是解决自杀效应的关键机制。此外，申请人还加强了CAR-T的临床应用，创新性的将CAR-T应用于14例难治/复发性中枢神经系统淋巴瘤患者、CD30阳性淋巴瘤患者以及极少见的遗传性疾病合并淋巴瘤患者，均取得了良好的疗效。本课题的完成，丰富和强化了CAR-T细胞的研发与应用，为进一步促进和改善CAR-T的临床疗效提供优秀的前期基础。本项目共资助发表论文11篇，其中SCI论文9篇，包括Blood cancer journal以及JITC等杂志，大于10分两篇，大于5分的3篇，均标注受到本项目资助。共毕业硕士生1名，即将毕业博士生与硕士生各1名，申请人基于本项目获得自然基金面上项目一项。