低频超声协同纳米级微泡促GDNF靶向治疗帕金森病的实验研究

胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）对帕金森病具有良好疗效,但不能通过血脑屏障。本课题组前期研究表明，纳米级微泡在低频超声波辐照下可开放超声辐照区血脑屏障，如能应用该技术使GDNF静脉注射后通过中脑血脑屏障，将促进该药的临床应用。本课题旨在研究应用低频超声波协同纳米级微泡开放中脑血脑屏障后使GDNF通过的可行性，并通过观察超声波及微泡参数对靶区血脑屏障开放程度、开放时效、脑组织损伤、药物分布特征等的影响，探索GDNF经静脉给药所需的参数阈值及安全开放血脑屏障的参数范围，从而为GDNF经静脉给药靶向治疗帕金森病提供实验依据。在此基础上，应用优化后技术介导GDNF经静脉靶向治疗帕金森病模型小鼠，并与纹状体立体定向注射给药方式对比，通过行为学检测及应用生化、免疫组化、TUNEL等技术，观察两种给药方式的治疗效果，以评估GDNF经静脉给药治疗帕金森病的临床应用价值。

背景低频超声辐照联合微泡，可安全、靶向、可逆开放血脑屏障，促神经治疗药物转运入脑，提供了一种无创性跨血脑屏障治疗中枢神经系统疾病新方法。目的①脂质纳米级微泡的制备、性质鉴定及安全评价。②低频超声Flash联合声诺维靶向开放小鼠血脑屏障技术的可行性及安全性；③优化低频超声Flash联合声诺维开放小鼠血脑屏障的技术参数，并评估其时效性及安全性。方法①采用改良薄膜分散法及机械振荡法联合制备纳米级脂质微泡，并进行物理性质及安全评估。②低频超声Flash经颅定向辐照小鼠一侧基底节区并联合静脉注射声诺维，伊文氏蓝示踪。实验分为空白组、微泡组、超声辐照组、超声辐照+微泡组。评估血脑屏障的开放范围及程度，HE染色及电镜评估安全性；③低频聚焦超声Flash经颅定向辐照小鼠一侧基底节区并联合静脉注射声诺维，按不同辐照时长、声诺维剂量及辐照间隔时间分组，伊文氏蓝示踪，评估血脑屏障开放范围及程度，选取最优参数。在优化后参数下评估血脑屏障开放时效性，HE染色及电镜评估安全性。结果①改良薄膜分散法及机械振荡法联合制备纳米级脂质微泡产率较高，微泡粒径及粒径分布更趋理想，稳定性增加。②空白组、微泡组及辐照组大体观均未见蓝染，荧光显像未见明显红色荧光。超声辐照+微泡组辐照区肉眼可见蓝染，荧光显像见大量红色荧光，荧光定量伊文氏蓝浓度明显高于其他组（p<0.01）。各组小鼠光镜及电镜观察均未见明显神经元损害及红细胞渗出，超声辐照+微泡组可见血管周围水肿及内皮细胞内吞饮小泡。③a随辐照时间延长脑组织内伊文氏蓝浓度逐渐增加且有统计学差异（p<0.05），3min达到平台；b随造影剂剂量增加脑组织内伊文氏蓝浓度逐渐增加且有统计学意义（p<0.05），0.2ml/25g达到平台；c辐照间隔越短脑组织内伊文氏蓝浓度越高且有统计学差异（p<0.05），间隔2s最优；d以优化参数进行辐照，随辐照后时间延长，脑组织内伊文氏蓝浓度逐渐降低，60min后达较低平台期。辐照后60min内光镜及电镜下均可见脑毛细血管周围水肿、电镜可见内皮细胞胞质内增多的吞饮小泡，水肿程度及吞饮小泡数量随时间延长呈逐渐减轻趋势，以辐照后1min最明显，辐照后4h后血管周围水肿消失，吞饮小泡数量稀少。此外，以上各组脑组织光镜及电镜下均未见明显神经元损伤。结论应用低频聚焦超声Flash技术联合微泡能无创、定向、可逆、安全地开放小鼠血脑屏障。