基于压电效应的NAD+与苹果酸酶非共价相互作用研究

NAD+与其依赖型酶的非共价相互作用是NAD+依赖型酶催化机理研究中的共性和关键问题。研究表明通过改变NAD+和苹果酸酶活性区域的结构并使之重新匹配，可以得到新的催化活性组合。但从有机小分子和生物大分子相互作用角度，对NAD+与相关酶的非共价相互作用，至今仍缺乏系统的规律性认识。本项目设计合成新型NAD+类似物，测定其物理化学和生物学性质。将NAD+及类似物与压电传感芯片共价连接，以石英晶体微天平和分子模拟为研究手段，通过考察NAD+及类似物与苹果酸酶/突变体的相互作用，结合分子对接数据分析，明确两者分子间力强度和参与相互作用官能团极性分布，以及相互作用常数（结合Ka和解离Kd）与表观活性常数（Km或Ki）的关系，揭示NAD+与苹果酸酶非共价相互作用规律。为开发高效还原α-羰基酸化合物的新型生物正交催化剂，研制NAD+依赖型酶的抑制剂提供重要理论依据和实验基础。

以项目计划书为基础，对项目的关键科学问题进行阐述，通过有机合成、电化学、光谱、基因突变、活性筛选、石英晶体微天平、等温滴定量热、晶体解析以及分子对接等方法，检测NAD及其类似物与ME及其突变体的相互作用情况，揭示NAD及其类似物与ME及其突变体的相互作用规律，主要进展如下：（1）设计并合成了29种新型的NAD类似物，通过尝试不同的耦连或缩合试剂，实现NAD类似物片段的键合，并优化其合成路线，组合多种分离介质，实现NAD类似物的纯化，结构经核磁共振和高分辨质谱表征；（2）测定了NAD类似物的电化学性质以及光学性质，为进一步深入认识了NAD及其类似物在氧化还原反应过程中的电子迁移规律，为光谱法表征小分子与蛋白质相互作用提供了实验基础和表征新思路；（3）将野生型苹果酸酶ME进行定点饱和突变，获得了苹果酸酶多位点饱和突变的文库，并开发了基于NAD类似物与ME突变体相互作用的筛选方法，获得了NAD类似物与ME突变体的相互作用功能组合及其生物学活性数据，为相互作用分析提供了实验材料，为生物正交体系的建立奠定了实验基础；（4）利用石英晶体为天平（QCM）和等温滴定量热（ITC）探讨了NAD类似物与ME及其突变体相互作用情况，分别从电化学和热化学不同角度，分析了具有生物活性组合的作用情况，甄别出具有相互作用但无生物学活性组合作用情况，为开发基于NAD相关蛋白为靶点的药物设计提供实验依据；（5）通过将NAD类似物与ME突变体中具有相互作用的组合进行晶体共培养，获得了大肠杆菌来源的突变型ME的晶体结构，并初步解析了酶晶体结构的信息，为ME突变体的进一步结构优化以及分子对接工作，提供了理论基础和实验材料。