基于工程化噬菌体纳米材料的中药材真菌毒素检测研究

At present, plenty of methods have been created using for the detection of mycotoxins, including chromatography-based method and immunochemistry-based method. In virtue to the advantages of simple operation and short detection time, immunochemistry-based method is becoming more and more popular. However, to some extent, the higher cost of monoclonal antibodies limits the popularization of this method. There are fewer reports for the detection of mycotoxins in Chinese herbal medicines. Moreover, the complex composition and matrix effects will affect the sensitivity of detection. In order to solve these questions, this project plan to screen specific phage, which will take the place of monoclonal antibodies, and construct engineered phage nanomaterials displayed with magnetic nanoparticles to isolate and purify mycotoxins. Meanwhile, immune chromatography test strip will be assembled with engineered phage displayed with colloidal gold nanoparticles using for multiply detection of mycotoxins. Finally, a real-time fast detection system will be established to detect mycotoxins in Chinese herbal medicines, which will provide scientific base and support for the quality and safety evaluation of Chinese traditional medicines.

目前用于真菌毒素检测的方法很多，主要包括色谱层析法和免疫化学法两种。其中免疫化学方法凭借其操作简单、检测时间短等优点越来越受到人们的青睐。然而，免疫化学检测方法中单克隆抗体的使用，导致其成本相对较高，一定程度上限制了该方法的推广。尤其是在中药材真菌毒素检测方面，利用免疫化学法进行检测的报道较少。另外，由于中药材成分比较复杂，基质效应强，会对检测的灵敏度产生较大影响。为了解决以上问题，本研究尝试：1）基于噬菌体展示技术筛选特异性较强的噬菌体克隆来取代单克隆抗体，以降低其成本；2）构建展示有磁性纳米颗粒的工程化噬菌体对真菌毒素进行磁性分离和纯化，降低中药材的基质效应。同时，利用展示有胶体金纳米颗粒的工程化噬菌体组装免疫层析试纸条，实现中药真菌毒素的多元检测。最终，建立一种实时快速的中药真菌毒素检测体系，为我国中药质量安全评价提供科学依据和技术支持。

真菌毒素是存在于谷物、果蔬等日用品中，以痕量形式存在的，由真菌产生的小分子次级代谢产物。长期摄入会引发许多慢性疾病，对人类健康造成极大威胁。同样，在中药材的生长、收获、贮存和运输过程中也会产生真菌毒素，对中药材的质量、疗效和安全性等方面也有影响。目前，色谱分析法和免疫化学法是用于真菌毒素检测的两种常用方法，尤其是免疫化学检测方法，凭借其操作简单，灵敏度高，检测时间短等优点备受青睐。利用噬菌体展示技术进行真菌毒素的免疫检测是对常规抗体免疫检测技术的有力补充，有时甚至可以代替抗体发挥免疫结合的效果。本研究基于噬菌体展示技术，从噬菌体随机多肽文库中筛选得到了分别与玉米赤霉烯酮抗体、赭曲霉毒素抗体和黄曲霉毒素B1抗体结合的小分子多肽，制备纯化得到相应的噬菌体后，通过亲和力测定，包括噬菌体滴度测定及噬菌体ELISA等方法，最终确定ZEN41、OTA26以及AFB66多肽为亲和力较高的多肽；通过棋盘法，确定抗体的最佳包被浓度为0.5ug/孔，噬菌体的加入滴度为4.0×10*10pfu。然后，分别制备了磁性纳米颗粒和胶体金纳米颗粒，并利用透射电镜进行表征。基于双展示噬菌体载体系统，构建了能够分别携带磁性纳米颗粒和胶体金纳米颗粒的工程化噬菌体纳米材料，一方面通过TEM电镜进行纳米表征，验证丝状噬菌体能够与纳米颗粒结合形成纳米线；另一方面，借助Western Blotting进一步鉴定了小分子多肽与相应毒素抗体的特异性结合能力。最后，制备了胶体金试纸条，并对杜仲、党参、铁皮石斛等中药材玉米赤霉烯酮毒素进行定性检测。与不经过磁性富集时相比，经过磁性富集后进行检测，可以提高试纸条检测的灵敏度。与商品化ELISA真菌毒素检测试剂盒相比，本研究制备的胶体金检测试纸条完全可以满足中药材真菌毒素的定性检测。本项目建立了一种快速的中药材真菌毒素检测系统，为我国中药质量安全评价提供了科学依据和技术支持。