L-异亮氨酸合成途径基因在谷氨酸棒杆菌中的模块化协调表达和代谢调控机制研究

L-Isoleucine (L-Ile) is an essential amino acid. It is widely used in products of food, medicine and feed. Previously, the genes responsible for L-Ile biosynthesis were expressed in Corynebacterium glutamicum. But the yield of L-Ile was low, the by-product was increased and the cell growth was inhibited. The major reason for the low yield is because the inadequate precursor oxaloacetate, the imbalanced expressions of the genes related to L-Ile biosynthesis causes the metabolic burden, which accumulates L-lysine and 2-ketobutyrate, greatly reduces L-Ile metabolic flux and inhibits the cell growth. In order to solve the above problems, the genes related to L-Ile production will be divided into three modules by oxaloacetate and L-threonine node. The gene expressions in the same module will be balanced via designing ribosome binding site and applying the described promoter library, which could precisely regulate the target genes’ expressive quantity. In order to enhance the productivity of L-Ile, the three modules will be combined and adjusted suitably in the modified chassis strain. The metabolic regulation mechanism of L-Ile biosynthesis in C. glutamicum will be elucidated by using proteomics methodology. The strategy and metabolic mechanism generated by this project will build a broad avenue for producing other amino acids in C. glutamicum.

L-异亮氨酸作为一种必需氨基酸，广泛应用于食品、医药和饲料等领域。申请人前期在谷氨酸棒杆菌中表达合成途径基因，提高了L-异亮氨酸产量，但是产率很低、杂酸增加、生长缓慢。主要是由于前体草酰乙酸供应不足和途径基因不协调表达，导致天冬氨酸半醛流入L-赖氨酸途径，损害L-异亮氨酸合成，并且使菌株积累2-酮丁酸，最终造成代谢负荷和细胞毒性。为了解决上述问题，本项目拟将催化L-异亮氨酸有关的基因以前体-草酰乙酸、中间物-L-苏氨酸为节点，建立上、中和下游表达模块；然后对处于同一模块的基因，通过改变核糖体结合位点和启动子，精准调控这些基因的表达量，从而协调代谢途径每个催化步骤。最后，通过模块间适配性调节和底盘构建，协调代谢途径的通量，实现L-异亮氨酸的高效合成，并从蛋白水平解析谷氨酸棒杆菌合成L-异亮氨酸的代谢调控机制。本项目中采用的策略和阐明的相关机制，将为理性改造谷氨酸棒杆菌生产其他氨基酸提供参考。

Corynebacterium glutamicum JHI3-156是一株L-异亮氨酸高产菌。该菌通过多轮诱变筛选获得，很难再进一步诱变提高其产量。本项目针对JHI3-156，通过转录组学和蛋白组学分析，解析了其L-异亮氨酸的高产机制，接着对该菌株进行了一系列代谢工程改造，进一步提高L-异亮氨酸生产水平。主要结论如下：.(1) 通过新一代高通量测序技术对JHI3-156进行了转录组学分析。在对数生长中后期收集JHI3-156和ATCC13869，提取总RNA，用六甲基随机引物将其中mRNA反转录成cDNA并进行了测序，对两种菌株中差异表达基因进行了注释。与对照菌相比，JHI3-156中有406个基因的转录水平上调，有237个基因的转录水平下调。KEGG pathway富集性分析发现，上调的基因主要有氨基酸代谢途径中hom和thrB，丙酸代谢途径中prpB2、prpC2、prpD2、cg2796、sucC、sucD和dtsR1；下调的基因主要有氨基酸代谢途径中soxA、glyA、Cg2455和serC，TCA循环途径中sdhCD、icd、sdhB、acn、mdh、sdhA、fumC、gltD、gltB和glnA。.(2) 结合二维电泳和质谱对JHI3-156进行了蛋白组学分析。在对数生长中后期收集JHI3-156和ATCC13869，进行全蛋白提取和二维电泳分离，每种样品均获得750个蛋白点。与对照菌ATCC13869相比，JHI3-156中有82个蛋白表达水平上调，123个蛋白表达水平下调；181个蛋白仅在ATCC13869中表达，而197个蛋白仅在JHI3-156中表达。从ATCC13869和JHI3-156中分别选取了13和18个蛋白点进行了MALDI-TOF质谱鉴定，确定了下列表达水平变化较大的蛋白：MetX、PrpC2、Sod、Gnd、CysK、FusA和SerS。.(3) 系统优化合成途径、分泌系统、辅酶及前体供给，提高JHI3-156中L-异亮氨酸生产效率.通过删除JHI3-156中的alaT、brnQ和alr基因，改变ilvA的天然启动子，在质粒中高表达alr、ilvBN、ppnK、lrp和brnFE基因，获得重组菌株WM005/pYCW-1-ilvBN2-ppnK1。重组菌经72h补料发酵可产生32.1g/L L-异亮氨酸，比对照提高34.3%。