基于蛋白表面相互作用的AChE酶定向固定化研究

针对当前食品安全和残留监控现状，本项目提出拟以AChE酶蛋白表面分子模拟为先导，通过以酶蛋白非活性位点为受体腔进行酶的定向固定配基的虚拟筛选，将目标蛋白酶定向固定到载体表面。通过对影响酶固定多项因素的考察，优化定向固定配基的组装和修饰方法；阐明固定化AChE酶机制，明确影响定向固定AChE酶稳定性的要素；建立基于蛋白表面相互作用的酶的定向固定新技术，为构建更加灵敏，稳定，高效的农药残留快速检测酶生物传感体系提供有力而可靠的实验及理论基础。

针对当前食品安全和农药残留监控现状，本项目以AChE 酶蛋白表面分子模拟为先导，通过以酶蛋白非活性位点为受体腔进行酶的定向固定配基的虚拟筛选，构建小分子配基库，进而获得一种新型酶定向固定化技术，并基于此采用电化学方法开发出新型酶生物传感器，用于有机磷农药检测。研究结果表明：.通过综合分析AChE酶蛋白表面性质信息及结构特点（腔深、疏水性、电性等），Sybyl软件与CASTp蛋白表面三维结构计算平台所获得的分析信息，最终选定Site1号位点为对接腔，作为定向固定化AChE酶小分子配基筛选的位点。.通过对近五万余个小分子化合物的筛选，最终选取2类（阿托品、类儿茶素黄酮类化合物），共5个化合物作为正式的AChE定向固定化的小分子配基。.荧光光谱实验证明5个小分子配基均与AChE酶表面具有相互作用，但相互作用强度具有不同。其结合强度由强到弱依次为二氢檞皮素>檞皮素>(-)-表儿茶素>(+)-儿茶素>阿托品。.分子对接结果可以看出， 4个类儿茶素黄酮类化合物（(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素、檞皮素、二氢檞皮素）小分子配基与AChE酶结合的构象较为相似，骨架基本重合，说明分子结构对结合构象直接具有决定作用，而结合强度的差异来源于小分子上活性官能团的位置和种类。阿托品的结合强度较弱是由于其分子中含有羟基等活性官能团的数量比类儿茶素黄酮化合物明显较少。.通过儿茶素定向固定的AChE酶生物传感器的底物ATCL的催化能力很强，将制作的AChE/CA/CC/CS/GCE进行电化学测量，所制得的传感器对底物ATCL具有很好的灵敏度，分别为：9.8μA mM-1，6.0μA mM-1。制备的AChE/CA/CC/CS/GCE电极具有更宽的pH适用范围和较低的检测电位，同时制作的生物传感器重复性相对标准偏差为2.6%，半个月后仍保持起始响应的81%，一个月后仍然维持在初始响应的80%，说明制备的传感器有很好的稳定性。.在最优条件下，以氯化乙酰硫代胆碱为底物，基于农药对酶的抑制原理，对毒死蜱进行了检测。农药的浓度与抑制率在0.5-60μg/L和60-150μg/L这两个范围内分别存在线性关系。线性方程分别为y=0.829x-0.386，R2=0.999; y=0.365x+28.82，R2=0.992。检出限为0.43μg/L。