不同亚细胞定位的TRPM2离子通道对胰岛素分泌的调控机制研究

TRPM2 is a voltage-independent cation channel expressed in pancreatic islets and mainly permeable to Ca2+ and Na+. The insulin secretion of TRPM2-knockout mice is significantly reduced compared to that of wildtype mice. TRPM2 channels are distributed at the plasma membrane and lysosomes, and mediate Ca2+ influx from extracellular space and lysosomal Ca2+ release, respectively, both of which lead to the rise of cytosolic Ca2+. Preliminary study of this project revealed that the insulin secretion-promoting drug glybenclamide can selectively activate lysosomal TRPM2 channels, but has no stimulating effect on TRPM2 channels at the plasma membrane, which may be a new pharmacological mechanism of this drug. Based on these observations, the difference in the regulatory roles of plasma membrane and lysosomal TRPM2 channels on insulin secretion from pancreatic β cells will be studied in this project. Important research tools including TRPM2-selective pore-blocking antibody (blocking plasma membrane TRPM2 channels from extracellular side) and TRPM2 dominant negative variant specifically localized in lysosomes (inhibiting lysosomal TRPM2 channels) will be used in this project. Detailed regulatory mechanisms will be analyzed by comparing the effects of differently localized TRPM2 channels on insulin secretion at different phases， which may provide novel insight into diabetes studies.

TRPM2是胰岛中表达的一种非电压依赖性阳离子通道，主要通透钙、钠离子。TRPM2基因敲除小鼠的胰岛素分泌水平与野生型个体相比表现出显著的下降，但是相应的生理学机制还没有得到阐明。胰岛β细胞中的TRPM2通道在细胞膜和溶酶体上都有分布，分别介导胞外钙内流和溶酶体钙释放，二者都引起细胞质的钙水平上升。本项目的初步研究发现胰岛素促分泌剂格列本脲能够选择性激活溶酶体TRPM2通道，而对细胞膜TRPM2通道没有刺激作用，这可能是该药物的一种新的作用机制。本项目将以此为出发点研究细胞膜和溶酶体定位的TRPM2通道对β细胞胰岛素分泌的调控作用差异，使用的主要研究工具为TRPM2特异性通道封闭抗体（从胞外阻断细胞膜TRPM2通道）和溶酶体定位的TRPM2功能失活突变体（抑制溶酶体TRPM2通道），通过比较不同定位的TRPM2通道对不同时相胰岛素分泌的影响，分析其作用的具体机制，为糖尿病研究提供新的思路。

本项目致力于研究胰腺beta细胞中定位于细胞膜和溶酶体上的TRPM2离子通道对胰岛素分泌的调节作用。为了特异性阻断细胞膜上的TRPM2通道，本课题组成功制作了可以识别并结合通道口肽段的兔源多克隆抗体，该抗体对可以有效抑制TRPM2通道的全细胞电流，对其它通道没有明显作用。将该抗体与小鼠beta细胞孵育后，细胞的胰岛素分泌显著减少。针对溶酶体上的TRPM2通道，本课题组构建了主要定位于溶酶体上的TRPM2功能失活突变体，该突变体的过表达可以抑制溶酶体的钙释放，但是由于细胞内吞和胞吐的高度动态化，溶酶体、内涵体和细胞膜之间的物质转运、交换、膜融合比较频繁，少量的TRPM2突变体也被转运到细胞膜上，抑制细胞膜上的正常TRPM2通道， 因此不能作为溶酶体上TRPM2通道的特异性阻断工具。此外，本项目还构建了糖尿病小鼠模型，对小鼠胰腺和肾脏组织中的离子通道及其功能进行了研究，取得了一项重要发现：在糖尿病状态下肾脏上皮细胞中的钙通道Orai1表达显著下调，与蛋白尿的发生直接相关。为了在整体动物水平上对Orai1在肾脏中的生理作用进行研究，本研究构建了整合Orai1突变体的转基因小鼠和近曲小管特异性的Cre小鼠，两种小鼠杂交后可以实现Orai1突变体在近曲小管中的特异性高水平表达，从而完全抑制内源性Orai1/2/3通道的功能。利用此动物模型本研究发现Orai1在近曲小管对白蛋白的重吸收过程中起着至关重要的调节作用，研究论文已投稿Nature Communications并完成了审稿人要求补充的实验，很有可能在上半年被接受发表（本项目负责人为并列第一作者）。截至2017年2月，本项目负责人已发表由本项目资助的SCI研究论文5篇，其中4篇为第一或并列第一作者，单篇最高影响因子5.1。