骨钙素促胰岛素分泌的离子通道调控机制研究

The development of new highly effective hypoglycemic drugs is the focus of the current antidiabetic research. Recent studies show that osteocalcin can stimulate insulin secretion, reduce insulin resistance, promote pancreatic β cell proliferation, and facilitate weight loss. These effects indicate that osteocalcin has the enormous potential in the treatment of diabetes. Therefore, an in-depth study of its mechanism of these actions becomes more urgent. It has been reported that the effect of reducing insulin resistance of osteocalcin is related to enhancing adiponectin expression in adipocytes, while the effect of promoting β cell proliferation is related to enhancing cyclingD1 expression. However, the mechanism underlying osteocalcin's insulinotropic effect has yet to be clarified. Our preliminary findings show that osteocalcin inhibits pancreatic β-cell voltage-dependent potassium channels and increases intracellular free calcium levels, suggesting that ion channels play an important role in the insulinotropic effect of osteocalcin. As variety of ion channels are involved in the regulation of intracellular free calcium and insulin secretion in β-cell, present project intends to investigate the role of osteocalcin on β-cell ion channels and its influence on the regulation of insulin secretion by applying multiple techniques (patch-clamping, calcium imaging, as well as in vitro pancreatic islets perifusion, etc). The aim is to obtain a more comprehensive understanding of the hypoglycemic mechanism of osteocalcin, and provide a theoretical basis for the development of new osteocalcin-like antidiabetic drugs.

开发新型高效降糖药物是当前糖尿病治疗的研发重点。近期研究表明，骨钙素可以促进胰岛素分泌，改善胰岛素抵抗，并具有促进胰岛β细胞增殖，减轻体重的作用，显示了其在糖尿病治疗方面的巨大潜力，因此深入研究其作用机制就显得更加迫切。然而目前对骨钙素促胰岛素分泌的作用特点及机制尚缺乏系统的研究，机制仍未阐明。我们的初步研究结果显示，骨钙素具有抑制胰岛β细胞Kv通道和升高细胞内游离钙的作用。鉴于已经证明β细胞Kv通道、KATP通道和Ca2+通道功能改变可影响细胞内钙水平，进而发挥调控胰岛素分泌的作用,我们分析这些通道可能在介导骨钙素对胰岛素分泌的调控中发挥着重要作用。本项目拟采用免疫印迹、膜片钳、钙成像以及胰岛离体灌流等方法，深入研究骨钙素促胰岛素分泌的作用机制，明确β细胞主要离子通道在其中的作用，从而使人们对骨钙素的降糖机制有一个更为全面的认识，为新型的骨钙素类抗糖尿病药物的开发利用提供理论依据。

骨钙素是骨中一种丰富的非胶原蛋白，研究表明未羧化形式的骨钙素能促进胰岛素分泌，但具体机制还未阐明。在本研究中，我们的实验表明，在高糖 （16.7 mM） 时, 未羧化骨钙素促进了离体大鼠胰岛的胰岛素分泌，但是，在低糖 （2.8 mM） 时没有此作用，表明未羧化骨钙素调节胰岛素分泌的作用依赖于葡萄糖浓度。通过应用Kv通道的阻断剂-TEA，我们发现，未羧化骨钙素促进胰岛素分泌和升高细胞内钙离子水平的作用都与Kv通道有关。为了进一步研究未羧化骨钙素促胰岛素分泌的电生理机制，我们进行了膜片钳实验。结果表明未羧化骨钙素通过抑制Kv通道延长了动作电位时程。目前的报道已经明确腺苷酸环化酶（AC）介导的蛋白激酶A（PKA）途径和磷脂酶C（PLC）介导的蛋白激酶C（PKC）途径是调节胰岛素分泌的两条重要途径，因此，我们观察了这些信号途径是否影响了未羧化骨钙素对Kv通道和胰岛素分泌的调控。结果显示，应用SQ 22536（AC抑制剂）没有影响未羧化骨钙素的作用。但是应用U-73122（PLC的抑制剂）、Ro 31-8220 (PKC的抑制剂) 、FTS-A （Ras的抑制剂）、U-0126（MEK的抑制剂）和PD 98059（MEK的抑制剂）则抑制了未羧化骨钙素在Kv通道和胰岛素分泌上的作用，而且在Westernblot实验中，未羧化骨钙素促进MEK磷酸化的作用也被U-73122、Ro 31-8220和FTS-A抑制了。这些结果提示PLC/PKC/Ras/MEK/Kv通道途径，在未羧化骨钙素刺激的胰岛素分泌中起着重要的作用。G蛋白耦联受体C家族6组成员A（GPRC6A）是近年来新发现的一种G蛋白耦联受体，是骨钙素的受体之一。但是大鼠胰岛中是否存在GPRC6A受体，目前还未见报道。为此，我们应用荧光定量PCR和普通PCR实验检测了SD大鼠胰岛中GPRC6A的相对含量，结果显示胰岛中不存在或极少存在GPRC6A基因的表达，提示骨钙素对大鼠胰岛素的促分泌作用可能不是主要通过GPRC6A受体完成的。总之，本项目结果表明未羧化骨钙素通过PLC/PKC/Ras/MEK途径，抑制了电压门控性钾通道，延长了动作电位时程，增加了细胞内钙离子水平，促进了胰岛素分泌。本项目深入探讨了骨钙素促胰岛素分泌的机制，使人们对骨钙素的作用有了更为深入的认识，为开发和利用骨钙素类抗糖尿病药物提供了理论依据。