耻垢分枝杆菌中c-di-GMP合成酶与引物酶DnaG之间的相互作用及其调控细菌生长的分子机制研究

C-di-GMP is a second messenger that widely regulates bacterial pathogenesis and could enhance Mycobacterial survival under nutrient starvation. However, the detailed regulatory pathways are still unclear. To address the issue, this study will systematically analyze the physical interactions between c-di-GMP synthase Ms2196 and primase MsDnaG of Mycobacteria based previous works and further investigate the effects of these interactions on Mycobacterial growth. Firstly, we will comprehensively detect the interactions among Ms2196, c-di-GMP and MsDnaG by integrating multiple experimental techniques of molecule interaction analysis. Then, we will dissect the regulatory effects of Ms2196 and c-di-GMP on primer synthesis function of MsDnaG by in vitro experiments. Finally, we will explore the effects of these interactions on Mycobacterial growth by determining and comparing the growth of Ms2196 knockout, over expression as well as Ms2196 and MsDnaG co-expression strain under nutrient starvation. Our study will facilitate the discovery of c-di-GMP mediated new signal pathway that regulate mycobacterial growth and will also provide new clues for antibacterial drug design.

C-di-GMP作为第二信使分子广泛参与调控细菌的病原性，能够增强分枝杆菌在营养胁迫下的生存能力，但是具体的调控途径尚不清楚。针对这一科学问题，本项目基于实验室已有的工作，在系统研究耻垢分枝杆菌中c-di-GMP合成酶Ms2196蛋白与引物酶MsDnaG之间的物理相互作用的基础上，进一步探讨它们对分枝杆菌生长的调控影响。首先，拟整合多种分子相互作用实验技术系统鉴定Ms2196、c-di-GMP以及MsDnaG三者之间的相互作用关系。然后，体外分析Ms2196蛋白以及c-di-GMP信使分子分别对MsDnaG蛋白引物合成功能的调控影响。最后，通过构建重组菌株，比较Ms2196敲除、超表达菌株及其与MsDnaG共表达菌株在营养胁迫条件下的生长，探讨两者相互作用对分枝杆菌生长的调控影响。本项目研究将有助于发现c-di-GMP信号分子调控分枝杆菌生长的新信号途径，并能为抗菌药物设计提供新的思路。

鉴定调控分枝杆菌DNA复制的调控因子对于认识分枝杆菌持续性感染的分子机制以及开发抗结核药物具有重要意义。引物酶DnaG是细菌染色体DNA复制的关键组分，c-di-GMP是一个参与调控多种细菌病原性的第二信使分子，在分枝杆菌中c-di-GMP能够增强细菌在营养胁迫下的生存能力。本项目以耻垢分枝杆菌作为模式生物，系统的研究了c-di-GMP合成酶Ms2196蛋白和c-di-GMP分子与引物酶MsDnaG的相互作用关系，取得了以下研究结果。（1）细菌双杂交实验、Pull-down实验和表面等离子共振实验结果表明Ms2196与MsDnaG在体外条件下具有相互作用。免疫共沉淀实验结果表明Ms2196与MsDnaG在体内条件下具有相互作用。（2）细菌双杂交实验、Pull-down实验和表面等离子共振实验结果表明Ms2196的N末端结构域与MsDnaG的C末端结构域介导Ms2196和MsDnaG两者之间的相互作用。由于MsDnaG的C末端结构域参与与解旋酶MsDnaB的相互作用，因此Ms2196可通过调节MsDnaG和MsDnaB的相互作用进而调控DNA复制活动。（3）紫外交联实验表明，c-di-GMP分子能够与MsDnaG的C末端结构域结合，并且MsDnaG的C末端结构域存在两个c-di-GMP结合位点（残基121-461和残基461-636）（4）C-di-GMP能够竞争MsDnaG天然底物GTP与MsDnaG的结合。由于GTP结合以及水解活性对于引物酶MsDnaG合成引物的活性是必需的，因此c-di-GMP可通过调节MsDnaG的GTP水解活性功能进而调控DNA复制活动。以上这些研究结果首次阐明c-di-GMP信号系统与分枝杆菌DNA复制关键因子引物酶DnaG之间的关系，表明c-di-GMP信号系统可通过两种方式，包括鸟苷酸环化酶Ms2196以及c-di-GMP分子来调控引物酶MsDnaG的功能进而调控DNA复制活动。因此，本项目的研究结果为我们认识分枝杆菌DNA复制的严谨调控,进而认识持续性感染以及在营养胁迫条件下的生长的调节机制提供了关键信息，也为未来新型抗结核药物靶标发现与药物筛选提供了重要线索。