一种新型蛋白酶在耐辐射球菌电离辐射抗性中的作用机制

An orphan DNA damage response regulator named pprI or irre was firstly detected by our research team ten years ago. The special regulator has been proved to control a series of essential proteins involved in DNA damage and response in Deinococcus radiodurans. However, its detailed biological mechanism remains unclear for these years. Recently, we found accidently that its gene product PprI could specially cut a certain substrate, and possess a kind of novel protease activity. This project is established to confirm the special enzymatic activity of this novel protease in vitro and in vivo, and to obtain the specific Restriction Enzyme Cutting Site through Mass Spectrometry, Western Blotting, Bimolecular Fluorescence Complementation method and Phenotype Analysis, to identify the downstream genes of its substrate and their expression in vivo through ChIP-seqencing, EMSA, Footprinting, combined with Real-time Quantative PCR technology. This research will illuminate the molecular mechanism of the newly discovered protease, so as to provide vital informations about its central role in DNA damage response and repair, and lay the foundation for its development and application in the future.

十年前，我们率先在耐辐射球菌中发现了一个DNA损伤修复开关基因pprI（也称irrE）。该基因在电离辐射抗性中起着举足轻重的作用，但具体机制尚不清楚。最近我们意外发现该基因产物具有蛋白酶活性，能特异性切割特定底物，属新型蛋白酶。本项目拟通过质谱技术分析、分子荧光互补技术和电离辐射表型分析等技术，进一步确定其在体内外的蛋白酶活性、特异性酶切位点及其酶活动力学；运用EMSA、Footprinting和ChIP-Seq等方法研究直接受其底物调控的下游基因及其抗性表型；并利用芯片技术和RT-PCR方法等研究底物突变株对下游基因表达和活性影响；同时在耐辐射球菌和其它物种内搜索同源性底物，以确定新型蛋白酶在电离辐射抗性中的特异性作用机制。通过本研究，旨在揭示该新型蛋白酶在电离辐射抗性中起作用的分子机理，为以此蛋白酶和底物为中心的特有DNA损伤响应机制提供新的理论依据，同时为其开发利用奠定基础。

我们研究团队率先在耐辐射球菌中发现了一个DNA损伤修复开关基因pprI（也称irrE）。该基因在电离辐射抗性中起着举足轻重的作用，但具体机制尚不清楚。最近我们意外发现该基因产物具有蛋白酶活性，能特异性切割特定底物，属新型蛋白酶。本项目通过质谱技术、Western和电离辐射表型分析等技术，进一步确定其在体内外的蛋白酶活性、特异性酶切位点、金属依赖性及其体内动态酶活水平；运用EMSA和ChIP-Seq等方法研究了PprI 蛋白酶和DNA-DdrO 复合物相互关系、直接受其底物调控的下游基因及其抗性表型；利用定点突变技术、RT-PCR方法等技术研究了底物突变株对下游基因表达和活性影响；同时进行了耐辐射球菌PprI蛋白酶的同源性底物搜索，以及PprI同源蛋白和DdrO蛋白的晶体结构探索，以确定新型蛋白酶在电离辐射抗性中的特异性作用机制。通过本研究，初步揭示了该新型蛋白酶在电离辐射抗性中起作用的分子机理，为以此蛋白酶和底物为中心的特有DNA损伤响应机制提供了新的理论依据，同时为其开发利用奠定了一定基础。