磷脂酰肌醇-4激酶β（PI4KB）调控Connexin 30.3在斑马鱼内耳发育中的作用及机制研究

Hearing impairment is the most common born defect which severely affects the communication and quality of life. In our previous investigations, it is found that knockdown of MO-pi4kb or pi4kb(M766R) mutation causes inner ear development defects. In addition, it is also found that the loss of pi4kb leads to defects of the gap junction in epithelium by electron microscope analyses. These finds suggest PI4KB is likely to interact with Cx30.3 in inner ear development. In this study, we aim to establish an amino acid point mutation pi4kb(M766R-/-) zebrafish line, and to study the effect of the inhibition or mutation of pi4kb on the morphological development of zebrafish inner ear, and to explore whether PI4KB interacts with Cx30.3 to affect the structure and function of gap junction in inner era development. We will also analyze the kinase activity of PI4KB(M766R) and its impact on the expression and location of Cx30.3 by in vitro cell experiments. These studies could improve our understanding on the molecular signal pathways in inner ear development and help to identify the molecular mechanism of deafness pathogenesis.

耳聋是最常见的出生缺陷性疾病，极大地影响着相互交流和生活质量。前期研究发现，沉默或定点突变磷脂酰肌醇-4激酶β（Phosphatidylinositol 4-kinase beta，pi4kb）基因后可导致斑马鱼胚胎内耳发育形态异常，超微结构观察发现pi4kb基因沉默导致内耳上皮细胞间隙连接结构受损，提示PI4KB可能通过Connexin 30.3（Cx30.3）对内耳发育过程产生影响。本研究拟构建单氨基酸突变的pi4kb（M766R-/-）斑马鱼，研究pi4kb基因缺失或突变对胚胎内耳形态发育的影响；探讨PI4KB是否通过Cx30.3导致细胞间隙连接结构和功能改变；并通过细胞实验证明M766R突变对PI4KB激酶活性以及Cx30.3表达和定位的影响，进一步探讨PI4KB如何通过Cx30.3影响胚胎内耳发育，从而完善胚胎早期内耳发育的信号分子调控网络，为明确人类耳聋的发生机制提供理论基础。

磷脂酰肌醇-4激酶家族包括II型和III型两种亚型，每种亚型又分为α和β两个类型，其中磷脂酰肌醇-4激酶β（PI4IIIβ，PI4KB）是相对研究最广泛，也是催化磷酸肌醇（PIs）生成磷脂酰肌醇-4磷酸（PI4P）的主要激酶之一，其中PI4P又是分布在高尔基体和细胞质膜上的一种重要的负电荷磷脂分子，对膜的通透性、囊泡运输、细胞骨架调整及信号传导发挥着重要作用，但是PI4KB具体的基因功能以及其发育生物学作用仍不明确。因此，本研究以斑马鱼作为模式动物，探究pi4kb基因在斑马鱼中的表达形式，并首次证实了该基因在斑马鱼内耳及侧线神经丘毛细胞中均有表达。同时，通过敲降、敲除或者点突变pi4kb基因验证该基因的发育生物学功能，本研究证实该基因对斑马鱼内耳形态发育具有重要影响，主要表现为耳泡变小、半规管融合异常、内耳毛细胞间间隙连接结构受损以及内耳嵴纤毛和侧线神经丘毛细胞数量明显减少。行为学实验结果表明，特异性敲降或敲除pi4kb基因时，均能够导致斑马鱼对声波刺激的反应显著减弱；在特异性沉默pi4kb基因的斑马鱼胚胎中共同注射野生型pi4kb mRNA则能够恢复部分斑马鱼胚胎内耳形态的正常发育，同时也能够部分拯救斑马鱼对声波刺激的反应，而共同注射单氨基酸突变的pi4kbM766R mRNA则无法起到拯救作用。此外，分别通过体外和体内的免疫荧光实验证实当特异性沉默或敲除pi4kb基因时，PI4P的合成量明显减少，从而阻碍下游磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PI（4,5）P2）的产生，进而影响毛细胞纤毛发生，最终导致听力功能障碍，该结果初步说明了pi4kb基因的致聋机制。综上所述，本课题的顺利完成为研究遗传性耳聋发生以及耳聋致病基因的临床筛查提供一个新的靶标。