gelE基因敲除引起粪肠球菌脂磷壁酸（LTA）结构及生物学效应改变的研究

Our previous study demonstrated that all Enterococcus faecalis isolates isolated from persistent root canal infection cases carried pathogenic genes, such as gelE, cylA, efaA and asa. ΔcylA, ΔefaA, Δasa and ΔgelE gene-knockout mutants had been constructed respectively. The characteristics of growth curve, resistance to antibiotics and mono-species biofilm formation were not changed in these mutants. However, ΔgelE mutants could not form a dual-species biofilm with Streptococcus mutans, contrastively, ΔcylA, ΔefaA, and Δasa mutants grew well with Streptococcus mutans. Lipoteichoic acid (LTA) is an important surface molecules performing several functions in gram-positive bacteria, such as biofilm formation and competition with host and other species. Our hypothesis is that the structure of LTA has been changed after gelE gene-knockout, and the biological function of the bacteria has also been affected. The hypothesis has been primarily proved: the absence of D-alanine in the LTA was also confirmed in ΔgelE mutants. The exact structure of LTA and its biological functions need further study.

申请人承担的“青年基金”研究结果表明：根管治疗失败病例中检出的粪肠球菌均携带gelE、cylA、efaA、asa等致病基因。本课题组分别构建了上述基因敲除的粪肠球菌突变株，ΔcylA、ΔefaA、Δasa等突变株与变形链球菌形成混合生物膜的能力未发生明显变化，但是ΔgelE突变株与变形链球菌形成混合生物膜的能力却显著下降。gelE基因敲除后粪肠球菌形成生物膜能力变化的原因是什么？脂磷壁酸（LTA）作为粪肠球菌表面物质，对于生物膜的形成、与宿主和其他菌种竞争都具有重要作用。本课题组提出假设：gelE基因的敲除，改变了LTA的结构，进而影响了粪肠球菌的生物学功能。该设想已得到初步验证：ΔgelE突变株LTA中D-丙氨酸的含量下降。gelE基因敲除后LTA结构的具体变化需要通过本项目进行更加深入的研究。

粪肠球菌的脂磷壁酸（lipoteichoic acid, LTA）属于经典的一型脂磷壁酸。其D丙氨酸的构象等结构会显著影响粪肠球菌的耐药性、致病性、粘附、形成生物膜和致病性。在我们的前期工作中，成功构建了粪肠球菌明胶酶基因（gelE）敲除的粪肠球菌突变株，并且发现该突变株与其他菌种生成混合生物膜的能力下降了。本课题组提出假设：gelE基因敲除后，LTA的结构发生了改变，进而影响了粪肠球菌的生物学行为。为验证上述假设，开展了本项目的研究。. 本研究的基础工作是对粪肠球菌脂磷壁酸的分离、提取与纯化。我们采用正丁醇两次萃取、离心，水相层析，真空过滤后得到LTA粗品。粗品经琼脂糖HIC后再经15%正丙醇（醋酸铵）层析，最终采用15%-60%正丙醇梯度洗提得到终样。 在LTA结构的分析中，主要采用了NMR和质谱进行分析。但与我们的预期结果不相符合的是，粪肠球菌标准株与gelE基因敲除株的LTA并未显现出明显差异。出现这一结果有两种可能性：gelE基因敲除后，粪肠球菌的生物学行为变化并不是由于LTA结构变化引起的；或者LTA的一级、二级结构虽未发生明显变化，但三、四级结构可能存在改变。还需要跟多的深入研究才能验证上述推断。. 由于本项目的资助期限仅有一年，属于探索性工作，相关工作仍在继续进行中，研究结果尚未公开发表；相关成果在本学科的国际学术会议中与国外同行进行了交流并获得认可。