纤维素可及度新型表征方法的建立及其用于纤维素预处理关键因素的研究

In the bioconversion of lignocellulose, cellulose accessibility (CA) is the major factor limiting the enzymatic hydrolysis of cellulose. It is also an important criterion to characterize the effects of lignocellulose bioconversion and pretreatment. However, few accurate methods that depict cellulose accessibility of cellulose and cellulase have been reported. In this project, a fusion genes of cellulose binding module (CBM) from Trichodema reesei combined with green fluorescent protein (GFP) will be constructed, recombinant expressed in Pichia pastoris GS115, and purified through chromatography method. Then a novel method to characterize CA of lignocellulosic biomass qualitatively and quantitatively using the fusion protein as a probe molecule will be developed. Based on this novel method, the mechanisms by which chemical compositions and physical structure of lignocellulose limit the cellulose accessibility will be investigated. In short this project we construct a novel tool to evaluate CA more accurately, which lay a foundation to construct methods that make it possible to improve the bioconversion and optimize pretreatment of lignocellulosic biomass.

在木质纤维素的生物转化过程中，纤维素的可及度是指纤维素酶对纤维素的可接触程度，是表征木质纤维素生物降解和预处理效果的重要标准。然而目前尚缺乏准确有效的纤维素可及度的表征方法。本项目拟构建瑞氏木霉纤维素酶的纤维素识别组件（CBM）与两个绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白CBM-GFP2，将其作为分子探针建立准确表征纤维素可及度的新方法；针对木质纤维素的化学组分和物理结构是限制纤维素可及度的主要原因，利用CBM-GFP2分子探针和分级预处理技术，解析木质纤维素化学组分和物理结构中影响纤维素可及度的关键因素及其作用机理。本项目为研究纤维素生物降解以及预处理过程提供新的、更准确有效的研究方法，同时为强化纤维素的生物降解和高效利用以及建立新型的木质纤维素预处理方法奠定研究基础。

由于化石能源短缺和环境破坏，人们开始着眼于发展可再生的生物质能源。其中以木质纤维素生产生物燃料尤为突出。但由于生物质的抗生物降解屏障，木质纤维素需要进行预处理以提高纤维素的可及度，从而利于纤维素的降解。纤维素的可及度是指纤维素酶对纤维素的可接触程度，是表征木质纤维素生物降解和预处理效果的重要标准。然而目前尚缺乏准确有效的纤维素可及度的表征方法。本项目通过选择并构建可用于纤维素可及度测量的新型探针分子，并进行实际应用，从而探究影响可及度的若干种因素的作用。首先，本项目以秸秆生物质为原料，通过选择性脱除半纤维素、木质素和控制反应度的乙酰化过程，获得了具有不同化学组分的样品，并结合细胞壁微观结构分析，解析了细胞壁结构因素对纤维素酶解性能影响的基本规律；其次，实现了瑞氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶纤维素结合单元CBM的基因有效克隆，并与双GFP蛋白基因成功连接，优化了CBM-GFP2蛋白的构建策略，获得了稳定的、可特异性识别纤维素底物的融合探针蛋白，并将该蛋白应用于可视化地、定量分析细胞壁结构特性对纤维素可及度影响的微观机制。最后，验证探针分子的可用性，并从化学组成和物理结构方面探究不同因素对可及度的影响。通过不同的预处理方法，从吸附结果和结构变化上分析证明半纤维素和木质素的存在会降低甘蔗渣中纤维素的可及度。另一方面，通过对麦秆进行Formile预处理及CPA后处理，使纤维素结晶状态改变，从而分析出结晶度对可及度存在影响。通过运用两种探针分子对不同木质素进行吸附，从而分析出Klason木素对CBM的无效吸附最为显著，与添加klason木素的滤纸酶解过程中受极大抑制现象相符合。