鸡卵黄免疫球蛋白糖基化修饰与功能特性的构效关系机制研究

Chicken egg yolk immunoglobulin (IgY) ，which extracted from egg yolk, is a kind of antibacterial, antiviral protein with biological activity and good immune characteristics. The separation and glycosylation modification of IgY can improve its stability and immune activity, which is an important scientific problems in IgY application. In this project, IgY are glycosylated modified by enzymatic method. The various factors of glycosylation are to be studied. The secondary structure of IgY and glycosylation sites are characterized, based on IgY function area and enzyme activity site for bioinformatics analysis, reveals IgY glycosylation modification and molecular conformation of related laws. At the same time, analysis and evaluation glycosylated IgY , to resolve the enhance the immune activity and stability of the glycosylation sites from the molecular level, and then reveals its molecular mechanism.

鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）是来自于鸡蛋蛋黄的一种具有抗菌、抗病毒等生物活性和优良的免疫特性的蛋白质。对IgY进行分离提取、糖基化改性的深入研究，改善其稳定性和免疫活性，是解决IgY在实际应用中的一个重要的科学问题。本项目通过酶法对IgY进行糖基化修饰，对IgY糖基化的各种影响因素进行研究,对糖基化后IgY的生物信息结构进行分析与表征, 揭示糖基化前后IgY的分子稳定性、免疫活性与分子构象的相互联系规律。解析出增强其免疫活性和稳定性的糖基化位点。对阐明卵黄免疫球蛋白的结构修饰与功能特性的构效关系以及分子机制有重要意义。

免疫球蛋白糖基化是非常重要的蛋白质翻译后修饰之一，糖链的存在可维持分子片段的活性构象，提高分子热稳定性，提高抗蛋白酶水解的能力。IgY糖基化位点、糖型结构对IgY分子的功能产生差异性的作用。本项目旨在选择比较不同糖型进行美拉德糖基化反应以及定位酶切，进行结构分析表征，对其热稳定、免疫活性以及肠胃稳定性进行构效关系分析。.本项目建立了一种多糖去脂液IgY提取方法，由0.1%果胶配制的去脂液分离纯化IgY的效果最好，提取量8.36mg/mL，纯度83.3%。选择了四种单糖利用美拉德反应对IgY进行糖基化修饰改性，对其产物进行结构表征。热稳定性数据表明单糖糖基化能明显改善IgY的热稳定性。天然IgY的热变性温度为70.4°C，葡萄糖糖基化IgY热变性温度在反应18d达到最高（79.8°C）。免疫活性数据表明，四种单糖IgY糖基化产物的免疫活性在反应到第6天达到最高，分别比IgY提高了30.3%、13.7%、12%、22.4%。糖基化产物在模拟胃肠液中的稳定性数据表明，天然IgY经过模拟胃肠液消化后活性保持率在20.1%。葡萄糖和岩藻糖糖基化IgY产物的免疫活性保持率均在18天达到最高，分别比天然IgY提高了201%和121%；甘露糖基化IgY产物在12天达到最高，比天然IgY提高了200%；果糖糖基化IgY产物在24天达到最高，比天然IgY提高了180%。.对IgY分子的糖链结构进行了表征。CD光谱表明去糖基化后IgY分子二级结构发生较显著的变化。内源性荧光光谱表明去糖基化后IgY分子疏水性变强，分子构象由舒展向紧凑状态转变，推测寡糖链的存在维护IgY结构的稳定性。盐酸胍变性实验证明，N-糖链的存在可将IgY抵抗盐酸胍诱导的去折叠能力提高了0.6 M。分析了糖基化位点、糖型结构以及糖链对IgY分子量的贡献率。检测到两个糖基化肽段SGSTYSLSSRVNVSGTDWR与PMVLQEHFNGTYSASSAVPVSTQDWLSGER，均为IgY重链肽段。其中前者中存在糖基化位点Asn308，后者含有糖基化位点Asn407。IgY的N-糖链包含了两种糖型结构：高甘露糖链、复合型糖链，并以高甘露糖链居多；糖链末端存在唾液酸、半乳糖修饰；糖链分子量5.5922 kDa，占IgY总分子量的3.29 %。