ALCAM分子调控多发性骨髓瘤肿瘤干细胞群的研究

Microarray-based bioinformatics analyses suggested that cell surface molecule ALCAM (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule) was highly expressed in multiple myeloma cells (MM). In our preliminary studies, ALCAM knocked down (ALC-KD) and control knocked (CTR-KD) MM cells showed no difference in cell growth, drug-response and colony formation. However, with the presence of bone marrow stromal cell (BMSC), ALC-KD MM cells formed more colonies in soft agar colony formation assay, compared with CTR-KD. In addition, subcutaneously co-injection of ALC-KD MM cells and BMSC exhibited faster tumor formation in vivo in SCID mouse. Hoechst staining assay showed that ALC-KD MM/BMSC coculture resulted increased ratio of stemness MM side-population (SP). Cell sorting followed by qPCR suggested that hedgehog pathway genes were altered in MM stemness SP cells during ALC-KD MM/BMSC coculture. More important, low ALCAM expression was associated with poor overall survival in MM patients, which was consistent with other preliminary results. Based on those findings, we hypothesized that ALCAM might regulate MM cancer stem cells in the tumor microenvironment with the presence of BMSC. Such ALCAM-mediated regulation was sufficient to affect MM prognosis.

ALCAM（Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule）是我们通过生物信息学筛选获知的一种在骨髓瘤内高表达的细胞表面分子。预实验显示，ALCAM敲减的骨髓瘤细胞（ALC-KD）与对照组(CTR-KD)在细胞生长、耐药、克隆形成（colony formation）等方面无差异。但在骨髓基质细胞（BMSC）存在时，ALC-KD具有更强的集落形成能力，且在动物体内成瘤更快。深入研究发现，ALC-KD/BMSC共培养，能显著提高骨髓瘤干性侧群细胞（side population）比率；与骨髓瘤干细胞调控相关的hedgehog信号通路也发生了改变。临床数据分析表明，ALCAM低表达是骨髓瘤预后不良因素；符合预实验结果。综上，我们提出科学假说：ALCAM可能参与调控处于肿瘤微环境中的骨髓瘤干细胞群；该潜在调控通路能够影响骨髓瘤预后。本项目将开展相关研究。

本项目研究了ALCAM因子对骨髓瘤肿瘤干细胞（Multiple myeloma cancer stem cell, MM-CSC）的调控。ALCAM因子是一种细胞粘附蛋白，已知在细胞间相互作用中发挥功能。我们在前期工作中发现，位于骨髓微环境中的多发性骨髓瘤（Multiple myeloma, MM）细胞，其ALCAM水平与肿瘤细胞的克隆形成能力相关——ALCAM水平越高，克隆形成能力越低。基于该发现，我们设计并完成了本项目研究。我们通过分子、细胞和动物实验说明了ALCAM对MM-CSC的调控，确定了ALCAM-EGFR蛋白互作在该调控中的核心作用。我们还在本项目研究的基础上，提出了新的MM靶向治疗策略，并进行了初步验证。.本项目的重要结果包括：.1）ALCAM能够与EGF竞争性结合到EGFR上。EGF-EGFR的结合能够启动胞内下游信号传导，促进MM-CSC形成；而ALCAM-EGFR结合切断下游相关信号传导，抑制MM-CSC形成。.2）不同MM患者差异化表达ALCAM。ALCAM水平与患者预后有相关性：ALCAM表达水平高的患者预后更好。在分子对ALCAM-EGFR中，ALCAM是起调控作用的关键分子（而非EGFR）。.3）MM-CSC较普通MM细胞具有更强的耐药性。ALCAM-EGFR分子对调控MM-CSC数量。在ALCAM水平低（MM-CSC数量高）的时候，常规治疗后有更多MM-CSC残存，这些细胞不利于MM治疗；反之，ALCAM高水平MM治疗后MM-CSC残存少，治疗效果更好。.4）使用EGFR靶向抑制剂能够降低MM-CSC水平，联合其他抗MM治疗措施，有利于MM治疗。.上述研究结果均未见文献报道。本项目研究的价值主要体现在两个方面。第一是确认ALCAM-EGFR分子对调控MM克隆形成，有助于我们理解MM的发生、发展过程。MM疾病在发生与进展中均伴随骨髓内新生肿瘤克隆的形成。我们的发现说明了ALCAM-EGFR在该过程中可能扮演重要作用。第二是提出了针对ALCAM-EGFR分子对的MM靶向治疗措施以及该治疗措施的临床研究评价标准。EGFR是其他一些肿瘤的治疗靶点，已有现成临床用靶向药。抗MM治疗药物联合EGFR靶向药能够提升MM治疗效果。由于EGFR抑制剂靶向的是耐药MM-CSC，不针对普通MM细胞，单纯使用EGFR抑制剂不能有效降低MM肿瘤负荷，需