枯草芽孢杆菌稳定期高效表达启动子P16功能元件的解析及优化

Bacillus subtilis, is the ideal host for the production of many industrial enzymes. A strong and controllable promoter is one of the key factors for efficiently expressing heterologous protein. Stationary phase specific promoters are the ideal promoters for the genes expression system , as they could express genes without inducer. Analysis and optimization of these promoters' core elements would explain the molecular mechanism of the genes expression specifically at the stationary phase and has important theoretical significance and application prospects. The analysis of the transcriptome of B.subtilis during the growth revealed that some genes were specifically expressed during stationary phase. Among the stationary phase specific promoters，we found the promoter P16 which the transcription activity is higher than the widely used constitutive promoter P43. Therefore, this study will analyze the cis-regulatory element of the promoter P16 by scanning mutagenesis, random mutagenesis, and the two fluorescent protein genes reporter system. The library of stationary phase specific promoters which cover a range of promoter activities with these elements will be constructed. These promoters can efficiently produce heterologous proteins without inducer. This work could play an important role in simplifying the production process and reducing cost in industrial production. Meanwhile, the analysis of these cis-elements provides theoretical basis for the research of the stationary phase physiological regulation in B.subtilis.

枯草芽孢杆菌是重要的外源基因表达宿主，强而可控的启动子是其应用的关键因素。特异在稳定期高效表达目的基因的自诱导型启动子，不需添加诱导物即可高效表达目的基因，是基因表达系统中的理想启动子。通过对枯草芽孢杆菌启动子相关元件的解析及优化，可解释其在稳定期特异高效表达目的基因的分子机制，具有重要的理论意义及应用前景。我们前期以枯草芽孢杆菌在不同生长时期的转录谱数据为基础，筛选得到稳定期高效表达的启动子P16。在此基础上，本研究将利用双荧光报告载体系统，对启动子P16进行生物信息学分析、结合扫描突变和随机突变分析、启动子元件功能验证等技术，确认启动子中调控稳定期特异性高效转录的顺式作用元件。利用这些元件优化启动子P16，并构建含一系列不同强度且在稳定期特异表达的启动子文库，用于表达不同的目的基因。该研究对简化生产工艺和降低生产成本具有重要应用价值，并为枯草芽孢杆菌稳定期生理调控机制研究提供理论基础。

枯草芽孢杆菌是重要的外源基因表达宿主，强而可控的启动子是其应用的关键因素。稳定期高效表达启动子，不需添加诱导物即可高效表达目的基因，是基因表达系统中的理想启动子。我们前期以枯草芽孢杆菌在不同生长时期的转录谱数据为基础，筛选得到稳定期高效表达的启动子P16。本研究旨在解析启动子P16中与其稳定期高表达相关的功能元件，构建能在稳定期高效表达多种外源基因的启动子文库，为高表达枯草芽孢杆菌工程菌株的构建提供了启动子资源。本研究通过截短突变和扫描突变确定了P16序列上影响其转录活性的功能区域位于-38~-23和-18~-3（包含–35区和–10区），随后，将此区域序列分成6个连续的包含4碱基的片段，并进行随机突变，构建了6个随机突变体库（T1-T2）。利用绿色荧光蛋白基因egfp作为报告基因，通过流式细胞仪测定了六个突变体库的平均相对荧光强度及样品变异系数。研究发现与–35区相邻的突变体库T2和T3对启动子活性影响最大，其中突变体库T2平均相对荧光最大，较野生型整体上调近20%，而突变体库T3库平均相对荧光最小，只剩野生型的一半，且变异系数最大。通过weblogo比对了两库分选出的极端突变体的突变信息，发现–35区前四个碱基中富含GC，–35区后四碱基富含C。进一步将T2位点突变为GGGG和CCCC（T2G和T2C），T3位点突变为CCCC（T3C），并用egfp基因，红色荧光蛋白基因mApple和有机磷水解酶基因ophc2检测突变启动子的活性，结果发现突变启动子T2G和T2C活性增强而T3C活性大幅度降低，说明P16的-35区的临近序列确实与其活性紧密相关。本研究结果丰富了枯草芽孢杆菌的启动子资源；此外利用此启动子构建的一系列不同强度的启动子文库，可以满足表达不同外源基因的需求，对大规模廉价工业酶制剂的生产具有实际应用前景。同时此启动子文库还能够用于代谢工程中精确控制基因的表达。.