结直肠癌中IGFBP7生物学效应的结构机制解析

本实验室通过前期一系列研究发现IGFBP7在结直肠癌中是个重要的抑癌基因，但其发挥抑癌作用的结构机制并不明确。本项目以IGFBP7与胰岛素的高结合性能为切入点，借助交叉学科的优势，依据并结合现有的同源建模、docking分析、in silico单分子实验、高通量势场建模等方法，预测IGFBP7与胰岛素的结合片段以及关键结合氨基酸。依据预测结果，构建截断、突变蛋白，检测其与胰岛素的结合能力，明确IGFBP7与胰岛素结合的结构域, 为设计药物调节IGFBP7与这些因子的结合力奠定坚实基础。同时将检测与胰岛素结合能力改变的突变蛋白在结直肠癌中的生物学效应, 推断IGFBP7与胰岛素的结合在结直肠癌中的作用，初步明确IGFBP7发挥抑癌生物学效应的关键结构机制，为下一步寻求准确的靶标打下基础。

IGFBP7是与胰岛素高亲和力的分子，前期实验我们发现了IGFBP7是结直肠癌的关键抑癌分子，本项目旨在通过探索IGFBP7与胰岛素的关键结合分子机制及其在结直肠癌中的生物学效应，进而明确IGFBP7在结直肠癌发挥抑癌效应的结构机制。我们计算机模拟预测发现IGFBP7与胰岛素结合的关键位点是Arg198和Hse200位点，并通过相互作用势能计算证实。我们对三组突变体198Glu，200Phe及198Glu200Phe的IGFBP7与insulin的结合自由能进行了计算，我们发现198Glu200Phe体系与insulin间的结合最弱，相互作用因突变而被切断。而对于单点突变体系，除Arg198，Hse200两处位点外，IGFBP7的末端Asp242（198Glu体系为Glu241）与insulin的Arg22具有很强的氢键，突变后的IGFBP7与insulin仍具有彼此自发结合的趋势，提示可能由于IGFBP7的末端残基柔性较大，可以对IGFBP7识别insulin起到保护作用，使二者的识别具有一定鲁棒性，从而保证其生物功能。上述发现得到了分子生物学的验证。我们构建并表达了198Glu突变蛋白M1, 198Ile200Phe突变蛋白M2, His200-Phe突变蛋白H200F, 并用Dot blot, Pull Down实验检测了其与胰岛素的结合能力，我们发现两点突变蛋白M2与胰岛素的结合能力明显下降, 而单点突变蛋白的结合能力并未明显减弱。我们进一步检测了IGFBP7突变蛋白在结直肠癌细胞的生物学效应。发现与野生型IGFBP7蛋白相比，IGFBP7-M2突变蛋白使胰岛素刺激的ERK磷酸化程度增强，也提示IGFBP7-M2可能由于与胰岛素结合能力减弱这一特点，而促使胰岛素更好地发挥后续生物学效应。同时我们也发现未经胰岛素刺激的结直肠癌细胞中，IGFBP7-M2可以引起ERK磷酸化，提示IGFBP7-M2本身可能有结合胰岛素之外的独立的生物学特性，可能通过非胰岛素结合的途径影响后续效应。通过该项目的实施，我们发现了IGFBP7与胰岛素的结合分子机制，发现结直肠癌细胞中，IGFBP7通过与胰岛素结合发挥后续生物学效应，阻断结合会逆转部分生物学效应。IGFBP7与胰岛素结合机制的发现为与胰岛素通路密切相关的肿瘤、糖尿病等重大疾病的药物设计提供了靶标。