基于微流控芯片的循环肝癌细胞检测、转移潜能和药敏分析

目前我们创建的磁性分选肝癌循环肿瘤细胞（CTCs）的方法具有用血量大、实验时间长、回收率低等弊端，且难以对分离的CTCs进行后续细胞培养和生物学实验，从而制约肝癌CTCs临床转化应用。新近发展起来的微流控芯片技术不仅可以高效分离稀少的CTCs，而且在细胞研究方面具有独特优势。本项目将肝癌CTCs磁性分选策略改进后移植到微流控芯片，进一步提高肝癌CTCs定量检测水平，并在芯片上采用FISH和多色免疫组化方法平行进行CTCs染色体8q和8p异常以及分子标志物CD133、Snail和OPN等表达检测（这些指标均与肝癌侵袭转移密切相关），以及垂直进行肝癌一线药物索拉非尼敏感分析，从而在评价CTCs计数与临床预后关系的同时，鉴定哪些异常改变是CTCs形成复发转移的关键因子，哪些患者CTCs具有索拉非尼耐药性，为临床医师提供有用信息，以便准确预测复发转移风险和疾病发展趋势，制定正确的个体化治疗方案。

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）复发转移率很高，循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）已被认为是其主要根源。目前通常采用基于上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）的策略分选CTCs，但是肝癌很少表达EpCAM，因此以EpCAM为靶标的分选策略并不适用于分选肝癌CTCs。之前我们根据肝细胞膜表面存在大量特异性去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）的特性，创建了一种独特的基于ASGPR的肝癌CTCs磁性分离方法。本课题主要内容包括进一步改进分选策略并移植到微流控芯片，提高肝癌CTCs检测水平，同时采用多色免疫组化方法平行进行CTCs分子鉴定，研究其临床意义。.在肝癌CTCs磁性分选策略改进方面，一是建立基于ASGPR、氨甲酰磷酸合成酶1（carbamyl phosphate synthetase 1，CPS1）和广谱细胞角蛋白（cytokeratins，CKs）等三抗体的肝癌CTCs检测方法。二是建立基于阴性选择的ASGPR和CPS1等二抗体的肝癌CTCs检测方法。这些改良方法减少了假阳性及假阴性结果，进一步提高了检测效率。.在发展肝癌CTCs相关微流控芯片技术平台方面，一是建立了基于微流控芯片的肝癌CTCs捕获与计数的方法。二是建立了微流控芯片捕获的肝癌CTCs释放后进行培养和药敏实验的方法。我们利用受体-配体结合原理捕获肝癌CTCs，然后用EDTA解离，将CTCs从微流控芯片上释放出来，而且可以在三维培养条件下生长成立体的细胞球，并在此基础上进行药敏试验。三是设计了一款网式微流控芯片，建立了微流控芯片内培养微量肿瘤细胞的方法。.在肝癌CTCs分子鉴定方面，（1）pERK+/pAkt-CTCs对索拉非尼最敏感，是接受索拉非尼治疗的肝癌患者无进展生存的一个独立预测因素。（2）肝癌患者Zeb1+/vimentin+组和Zeb1+/vimentin-组无进展生存期最短，肝癌CTCs表达Zeb1以及CTCs共表达Zeb1与vimentin是影响肝癌术后复发的独立预测因素。.在项目实施过程中，主要培养了3名研究生，发表了7篇项目标注SCI论文，参加了1次国际会议交流，申请了1项发明专利。