ENO1在HBV复制中的分子机制研究

ENO1 is a rate-limiting enzyme of glycolysis reaction.It is shown by our recent research that ENO1 is provided with the fuction of promoting HBV replication.And it is the first time our human beings come to aware of this action.However the regulation mechanism for HBV replication is unclear. Interactions between proteins encoded by HBV and host cells are important factors that lead persistent infection with HBV. The complex interactions between host cells and proteins encoded by HBV and interferon are the basic of occurrence, development and prognosis of hepatitis.The datails of these intereations are not very clear,which now hinder the new therapy and dugs used to treat HBV. " QUICK " strategy ,which is the study of protein function network ,is currently the most advanced strategy. In order to clarify the impotant role of ENO1 in hepatitis B virus diseases mechanism development, this study used " QUICK " strategy in HepG2.215 Hepatitis B cell model of HBV replication in order to make rapid and effective identification of proteina that was combined with ENO1 and Thus achieve the interaction networks between ENO1 and proteins in hepatitis B. Combined with the functional analysis of the interraction beteen ENO1 and the selected key protein .In order to make further connection between ENO1 and these proteins complex .Aims to elucidate the action mechanism of ENO1 in HBV replication, and provide a theoretical basis for finding new therapeutic targets.

ENO1是磷酸戊糖途径的关键酶，我们最近的研究首次发现ENO1具有促进HBV的复制的作用，但其详细的作用机制尚不清楚。HBV编码蛋白与宿主细胞之间的相互作用是导致HBV持续感染的重要因素。HBV与宿主细胞之间相互作用研究进展滞后是当前导致HBV新型治疗方法和药物研发滞后的重要原因之一。"QUICK"策略是研究蛋白质相互作用最可靠的策略。本项目拟采用"QUICK" 策略，在乙肝病毒复制的HepG2.215细胞中快速、有效的筛选出与ENO1相互结合的蛋白质，绘制出与ENO1相互作用蛋白质网络图；结合研究蛋白质功能的手段，对这些筛选出的关键蛋白与ENO1的相互作用进行功能研究，从而将这些组分与ENO1的功能进一步联系起来，力图阐明ENO1在HBV复制中的机理，从而找到一些潜在的药物治疗靶点。

我们发现ENO1在HBV相关疾病的血清、肝组织、细胞株中呈高表达。敲减HepG2.2.15细胞株ENO1表达水平能显著降低细胞的增殖、迁移、侵袭能力，细胞培养上清中的HBV-DNA、HBsAg、HBeAg定量水平呈显著减少，而参与HBV复制的Ⅰ型干扰素及下游多个干扰素刺激基因：IFNα1, IFNβ1以及下游的5个干扰素刺激基因(OAS1, ISG15, OAS3, EIF2α,PKR)的mRNA水平则均呈明显升高，与肿瘤迁移、转移相关的Notch信号通路激活相关的下游靶基因基因(HEY1、HES1、HES5)及Notch水解蛋白（N1ICD）、snail、slug的表达显著下调。因此，ENO1高表达很可能是HBV感染造成的，ENO1可通过影响Ⅰ型干扰素途径调控HBV复制，并可通过Notch信号通路调控肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭。为了进一步探讨与ENO1相互作用的蛋白在HBV感染相关疾病中的作用，我们采用"QUICK" 策略研究发现ENO1在HepG2.215细胞中与40个蛋白存在相互作用，其生物学功能涉及蛋白质代谢酶类、分子伴侣、生物氧化相关酶类，细胞骨架蛋白、信号转导、酶解等相关蛋白。我们采用免疫共沉淀结合Western blot及激光共聚焦验证了ENO1与候选蛋白PCNA、HSP90、PCBP1、PSME1、PBP存在相互作用。敲减ENO1表达后，HepG2.215细胞的增殖明显被抑制，细胞周期进程减慢，G1期比率明显增加，S期比率减少，G2期比率则无明显变化，与细胞增殖和周期相关的互作蛋白PCNA及因子（cyclinA2、cyclinD1、cyclinE2）、细胞周期依懒性蛋白激酶CDK1水平均明显下调，与细胞周期进展相关的MAPK通路相关因子磷酸化水平明显被抑制，P21水平明显升高，而细胞周期依懒性蛋白激酶CDK2-14、CDK2-160的水平则无明显变化。ENO1可与PCNA相互作用通过影响MAPK通路相关因子的磷酸化过程调控HBV相关肝癌细胞的的增殖及细胞周期。最近我们发现血清ENO1检测还具有肝癌诊断价值。综上所述，ENO1是一种与HBV感染复制及恶性化转变密切相关的宿主蛋白，对其作用和功能机制的认识可部分阐明HBV感染复制及恶性化转变的机理，并可能成为临床治愈和诊断HBV感染相关疾病的潜在的疗靶点。