卵形鲳鲹TLR3和TLR7亚家族鉴定及其信号通路在抗细菌感染中的作用机制

Toll-like receptors (TLRs) are one group of archetypical PRRs. Among the family of TLRs, TLR3 and TLR7 subfamily that expressed in endosomal compartments are known to be involved in antiviral immunity, but latest research shows they may be also involved in antibacterial immunity of fish. In our preliminary study, we analyzed the TLR3 and TLR7 subfamily of pomfret (Trachinotus ovatus), and find the expression of the two subfamily significantly upregulated after bacterial infection. In this study, we will examine the relevant antibacterial immune responses induced by TLR3 and TLR7 subfamily, and explore the relationship between these receptors and TLRs signaling pathway. (i) Analyze their expression under normal and bacterial infection conditions; (ii) Investigate the change pattern of related gene expression and immunological indexes in the signaling pathway and determine the possible immune activation pathway mediated by TLRs at the cellular and molecular level; (iii) Explore the roles in immune defense against bacterial of TLR3 and TLR7 subfamily agonist and the potency as vaccine adjuvant for fish. The project will provide insights to the working mechanisms of TLR3/7 subfamily and their agonists against bacterial infection in fish, and shed new light on function and mechanism of TLRs, and may exploit vaccine adjuvant for the control of pathogens infection in farmed flounder.

Toll样受体(TLRs)是一类重要的模式识别受体，TLR3和TLR7亚家族是TLR家族的重要成员，不仅参与机体抗病毒免疫，最新研究表明其在鱼类抗细菌免疫中也具有重要作用。为了解这些受体及其信号通路在抗细菌感染中功能与作用机制，本项目以海南深水网箱养殖主要品种卵形鲳鲹为研究对象，在克隆与鉴定TLR3和TLR7亚家族模式受体的基础上，通过不同细菌性病原刺激从转录及蛋白水平阐明其基因表达模式及调控规律；通过过量或干扰表达，系统分析各受体间相互关系，明确其接头蛋白及信号转导分子，揭示其参与机体抗细菌感染的主要调控机制；筛选卵形鲳鲹细菌性疾病免疫相关TLR3/7配体并研究其免疫学功能、信号通路及应用前景。研究结果不仅首次揭示TLR3/7亚家族信号通路在抗细菌感染中的作用机制，还有助于了解卵形鲳鲹TLRs及其配体在抗细菌感染中的免疫学功能及应用前景，为卵形鲳鲹等鱼类细菌性疾病的免疫防治提供理论依据。

细菌性疾病是目前水产养殖中的极为重要的一类病害，严重危害水产养殖业的可持续发展。在水产疾病防治的各种措施中，疫苗被认为是一种非常有前途的治疗手段。而重组、合成或天然制剂（细胞因子，趋化因子，寡核苷酸和咪喹莫特等）通常被用来作为免疫细胞的活化剂或疫苗佐剂，以激发或重塑宿主免疫系统来产生Th1型细胞和体液免疫应答，最终实现消灭病原体的目的。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是天然免疫系统中重要成员，能够广泛特异性地识别病原体表面的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)。TLRs家族广泛表达于多种细胞，包括上皮细胞、内皮细胞、间皮细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞和DC。其中，表达于细胞内体的TLR7/TLR8和TLR9，能够直接或间接活化多种免疫细胞，诱导机体产生先天性和获得性免疫反应。因此TLR3和TLR7亚家族受体是机体抗病感染过程中的重要参与者，最新研究表明其在鱼类抗细菌免疫中也具有重要作用，而其配体则成为抗病免疫治疗的最佳免疫调节剂。本项目以海南深水网箱养殖主要品种卵形鲳鲹为研究对象，在克隆与鉴定TLR3和TLR7亚家族模式受体的基础上，通过不同细菌性病原刺激从转录及蛋白水平阐明其基因表达模式及调控规律；通过过量或干扰表达，明确了TLR3和TLR7亚家族参与了机体抗细菌免疫；以细菌为感染因子，观察TLR7/8激动剂R848和TLR9激动剂CpG ODNs对细菌复制的抑制能力，进而从细胞和分子水平，探讨这些激动剂与TLRs信号通路之间的关系；通过细胞免疫学检测，我们发现这些激动剂均可以诱导卵形鲳鲹的免疫反应，调细胞内免疫相关基因的表达；进一步的研究发现介导免疫学效应很大程度上依赖于模式识别受体TLR，衔接分子MyD88，以及NF-κB的活化。研究结果初步揭示卵形鲳鲹TLR3/7及其配体所参与的免疫学功能、信号通路，以及在水产养殖中的应用潜能。